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[开发实例] 【PROTAC】新药开发系列(五)降解AR的“整体小分子”设计

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发表于 2019-2-24 11:21:51 | 显示全部楼层 |阅读模式

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前面三篇文章介绍了CraigM. Crews等人在2001、2003和2004年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶E3体系SCF(Skp1-Cullin-Fbox)、VonHippel-Lindau tumor suppressorprotein(VHL)与甲硫氨酰氨肽酶2(MetAP2)、雌雄激素受体(ER和AR)和抗免蛋白FKBP12(FK506bindingprotein)的激动和抑制剂,设计合成了用于降解MetAP2、ER、AR和FKBP12的PROTAC分子。蛋白试验验证了PROTACs可快速降解目标蛋白。

                               
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1PROTAC泛素化降解机制
但以前的PROTAC均使用了多肽,虽然已经可以透过细胞膜,但多肽PROTAC本身分子量高、且肽键不稳定,导致合成、纯化和稳定性方面的诸多问题。为了克服这一系列问题,研究者采用了“整体小分子”的PROTAC设计。
“整体小分子”PROTAC设计是一端采用了选择性雄激素受体调节剂(SARM)如图2中的分子,Ki=4nM,一种非甾体AR配体;另一端利用了另一个E3体系MurineDouble Minute 2(MDM2)抑制剂Nutlin,如图3中的分子,IC50=90nM。

                               
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2 ARSARM的结合模式
图2中的红色圈,显示了SARM与PEGLinker连接的位置。图3中的红色圈,则显示了Nutlin与PEGLinker连接的位置,环酰胺的N处。

                               
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3 MDM2Nutlin的结合模式
MDM2是一个已知的抗癌靶蛋白,其抑制剂作用机制是是竞争性结合在其与p53结合的位置(如图4,Nutlin和p53与MDM2结合在同一位点),从而阻止p53被泛素化标记,使得p53不被蛋白酶体降解。

                               
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4 MDM2(绿色)与Nutlin(白色)和p53(紫色)的结合模式
到目前为止,MDM2的抑制剂还未有获批上市的。推进最快的两个化合物是RG7112和RO5045337也只是完成了一期临床,如图5。国内江苏亚盛医药的MDM2抑制剂在2017年7月获CFDA一期临床批件。

                               
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5 MDM2抑制剂研究进展
研究者采用图6的路线合成了“整体小分子”PROTAC。接下来使用10μM的PROTAC与Hela细胞在37℃下共孵育。7小时后制备细胞裂解物,通过SDS-PAGE分离,并转移到硝酸纤维素膜上,使用AR抗体评估Western印迹以确定AR蛋白水平。

                               
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6“整体小分子”PROTAC的合成路线
试验结果显示,与空白试验对比,用PROTAC处理的细胞中AR明显降低(图7)。为了验证PROTAC诱导雄激素受体降解是通过蛋白酶体途径,研究者用10μM蛋白酶体抑制剂环氧酶素预处理细胞1小时,然后进行空白试验和PROTAC降解试验。结果如图7所示,PROTAC介导的降解具有蛋白酶体依赖性,环氧酶素与PROTAC竞争性结合AR,导致AR降解减少。

                               
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7 “整体小分子”Protac降解AR的效果

下一周,将和大家分享一篇PROTAC设计的综述:Designand Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads AreBetter Than One,敬请关注分迪科技微信公众号。

参考文献
1. Schneekloth,A. R.; Pucheault, M.;Tae, H. S.; Crews, C. M., Targeted intracellularprotein degradation induced by a small molecule: En route to chemicalproteomics. Bioorg Med Chem Lett 2008, 18(22), 5904-8.

【分迪科技 PROTAC践行者】

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发表于 2019-3-11 17:23:33 | 显示全部楼层

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木有金币购买
发表于 5 天前 | 显示全部楼层

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学习了,多谢金币!
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