【PROTAC】新药开发系列（十七）PROTAC设计的要点

川大-灰太狼 · 发表于 2019-4-28 09:49:36

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【PROTAC】新药开发系列（十七）PROTAC设计的要点

在这篇4月17日发表的文章中，Arvinas公司创始人Craig Crews第一次系统地介绍了PROTAC设计中的影响因素，也展示了PROTAC开发中的不足，这为科研者提供了一些值得去探索的方向。不过，Craig在这些影响因素中仅是点到为止，还需大家仔细琢磨。同时，PRTOAC三联体的技术在成药性方面的问题将大大限制其在药物开发中的应用。Craig Crews也称PROTAC的透膜性可能是因为胞膜将PROTAC分子识别为两个小分子。如果是这样的机制，那么Linker的长度就至关重要了，多长的Linker使得胞膜将其识别为两个小分子呢？如果这个长度的Linker的蛋白降解效果不好呢？而短的或者更长的靶点降解效率更好，但却不能被胞膜识别呢？分迪科技的PRODED技术从另一个角度利用蛋白降解机制，基于结构开发一体化的蛋白降解剂，实现一般化学药物大小（分子量500Da左右）的分子即可靶向降解致病蛋白。

摘要

使用蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）的靶向蛋白质降解已经成为药物发现中的新模式。PROTAC利用E3连接酶泛素化标记靶蛋白（POI）以诱导其被26S蛋白酶体降解。这种蛋白降解机制已被用于各种疾病相关POI的降解。本综述中将重点介绍降解POI的PROTACs分子最新研发进展，并揭示如何有效地开发PROTACs分子。

一、背景

靶蛋白必须经泛素标记才能被26S蛋白酶体降解。最早发现蛋白降解的ATP依赖性途径是在1970年，但第一个应用蛋白降解机制开发双功能分子的报道则是在三十年后。PROTAC是异双功能分子，其由以下组成：（1）结合POI的配体;（2）招募E3连接酶的配体;（3）连接两个配体的中间Linker（图1）。迄今为止，有100多篇文献报道了PROTAC用于降解靶蛋白（WebofScience搜索：2018年2月14日）及其在化学生物学和药物开发中的应用。在该综述中，研究者介绍了降解POI的PROTACs分子最新研发进展，并讨论了有效的PROTAC设计的基本原理，当然，这些原则仍有待商榷。

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图1 PROTAC诱导的POI泛素-蛋白酶体途径降解机制和占据驱动的抑制剂存在的问题

PROTAC诱导的蛋白质降解机制

泛素通过酶促级联反应结合靶蛋白。首先，E1泛素活化酶通过ATP依赖性机制形成E1 ~ ubiquitin泛素共轭物，然后将泛素转移到E2上，形成E2 ~ ubiquitin共轭酶（图1）。最后，由E3连接酶将E2上的泛素转移到靶蛋白上，完成标记。

E3连接酶通过非共价或共价机制介导靶蛋白泛素化标记，这取决于E3的类型。E3主要有三个家族：包括RING/U-box和HECT和RING - Between - RING （RBR）。招募E3是通过识别特异性降解的基序，称为降解决定子，也就是E3特异性结合配体。例如，UBRE3通过N端规则起作用，其中“失稳”的N端氨基酸促进UBR介导的泛素化；VHL的E3识别HIF1-α，其中羟基化的脯氨酸是HIF1-α结合VHL的关键部分。表1中列出了目前已有的E3特异性结合配体，它们是设计PROTACs的基础。

表1 最近发现的E3特异性结合配体，箭头表示用于连接Linker的位点

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PROTACs分子利用E3连接酶泛素化标记POI，然后由26S蛋白酶体将其降解（图1）。其中，泛素化标记过程中PROTAC诱导了三元复合物（POI: PROTAC: E3）的形成。由于PROTAC仅起到连接触发作用，未在此过程中被降解，因此，它是可以反复的促进多个POI被泛素化标记，并诱导其降解，只需要皮摩尔级别的剂量即可。这是一种催化的、事件驱动的模式，与传统抑制剂形成强烈对比。在抑制剂的占据驱动模式下，持续的靶标结合对于蛋白功能的抑制是必不可少的。在占用驱动的药物开发范例中，效力依赖于结合亲和力。但，抑制靶蛋白可能不会影响非催化靶蛋白功能（图1b）。也就是说，在靶向过度表达、存在竞争性天然配体或靶蛋白突变导致靶向结合丧失的情况下，持续靶向结合是无法实现的（图1b）。由于PROTACs是通过降解靶蛋白来实现抑制蛋白功能，因此该事件驱动模式可用于规避上述传统占用驱动模式的抑制剂的共同缺点。

二、PROTAC技术的现状

在过去的几年中，靶向蛋白质降解的PROTAC技术在学术和工业界中都引起了大家的高度关注，各种类型的靶蛋白被成功降解（表1）。与广泛的被降解的靶蛋白相比，仅有较少的可用E3连接酶。

1、PROTAC介导的表观遗传学蛋白的降解

目前，已经开发了一些PROTACs用于降解核蛋白，如组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）。例如，Sirtuin2（Sirt2）是一种NAD+依赖的III类HDAC，通过将SirReal3b（一种有效的Sirt2抑制剂）用一种三唑Linker与沙利度胺连接起来的PROTAC将其降解。该PROTAC分子具有Sirt2选择性，在Hela细胞中表现出微摩尔级别的活性。在诱导下游α-微管蛋白超乙酰化的同时，PROTAC保留了对Sirt2的抑制活性，并以CRBN和蛋白酶体依赖的方式促进Sirt2降解。同样地，使用含有羟肟酸基的HDAC6抑制剂连接泊马度胺的PROTAC实现了HDAC6（一种IIb-Zn2+依赖性HDAC）的降解。由于大多数HDAC抑制剂结合位点均含有Zn2+，降解可能有助于表征HDAC在疾病发展和进展中的非催化作用。

2、挑战抑制剂的亲和力和耐药机制

最近，一种基于恩杂鲁胺的PROTAC (ARCC-4)可在皮摩尔级别诱导VCAP细胞（一种去势抵抗性前列腺癌细胞）中的雄激素受体降解。ARCC-4的效力超越了恩杂鲁胺，同时还规避了由于以前的治疗方案而出现在患者身上的耐药机制。在研究PROTAC诱导膜结合受体酪氨酸激酶（RTK）降解时，也显示了降解优于抑制的效果。作为一种主要的药物靶标，已有47种小分子激酶抑制剂获得FDA批准。有一些抑制剂已用于设计降解丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶的PROTACs分子。尽管抑制受体酪氨酸激酶（RTK）的临床试验已经成功，但常观察到替代激酶的补偿性反馈被激活，这是一种耐药机制。如前所示，在降解其它靶蛋白（AR）时，降解可以规避耐药机制。含RTK抑制剂的PROTAC分子可降解与膜结合的WT-EGFR以及与疾病相关的EGFR突变体。此外，与仅由抑制引起的激酶反馈性增长的耐药机制相比，研究者观察到RTK下游信号的持续抑制时间更长，这也显示了降解优于抑制的效果。

有趣的是，泛激酶配体在PROTAC中的应用为PROTACs诱导靶蛋白的选择性降解奠定了基础。Foretinib可结合超过130种激酶。但将其与不同的E3（即VHL与CRBN）配体连接设计的PROTAC分子，试验观察到其降解的蛋白无重叠性。此外，即使使用一些与激酶（如p38α）结合较弱的抑制剂设计的PROTAC也观察到了降解效果，这可能是由于三元复合物中p38α和VHL之间通过蛋白-蛋白相互作用（PPI）的正协同作用所致。

类似地，含泛激酶配体的PROTACs利用CRBN来降解激酶，也显示出不同的靶向降解特征，且与细胞系无关，这进一步证实了靶向亲和力和降解效率之间的并无直接联系。有趣的是，使用含有VHL配体的PROTAC，研究者观察到强大的TBK1降解效果（>70％），但相对于典型的VHL抑制剂，其与VHL亲和力却降低了三倍（表1），这进一步支持了靶蛋白或E3配体的亲和力并不能决定PROTAC的降解效果。PROTAC的设计并不一定需要高亲和力的靶蛋白和E3结合配体，因此可被PROTAC降解的靶蛋白将会扩展到更多。

3、'无效'配体也可用于降解靶蛋白

除了不需要高亲和力配体来确保PROTAC降解的有效性外，缺乏调节细胞靶蛋白功能的配体也可用于设计PROTAC降解靶蛋白。比如，Trim24-溴域（BD）的有效和选择性抑制剂在Trim24内源性表达细胞中很少或没有显示出效果，这表明单独的BD抑制可能不足以治疗Trim24依赖性癌症。有趣的是，利用对Trim24具有较低亲和力和选择性的配体来设计PROTACs（dTRIM24）则可以高效的降解该蛋白。dTRIM24诱导的Trim24降解揭示了其RING结构域在急性白血病细胞增殖中的重要性，同时否定了先前认为其在MCF-7肿瘤细胞中的依赖性。该例子说明，“非功能性”的选择性配体可以被Protac技术用来降解靶蛋白，以证明该蛋白在疾病发展和进展中的功能与重要性。

4、PROTAC工具箱

BD和外末端（BET）结构域家族在关键致癌驱动基因的转录控制中发挥作用，是非常有吸引力的靶点。两种BD抑制剂OTX-015和JQ1已被用于设计降解BET的PROTACs，其POI: PROTAC: E3三元复合物被认为是一种典型模式。BRD4: PROTAC: VHL三元复合物的结晶数据揭示了PROTAC促进蛋白质: 蛋白质相互作用，BRD4的BD2与VHL的接触面积有700平方埃。有趣的是，PEG连接子（Linker）在三元复合物中形成额外的蛋白质-配体相互作用。相比之下，在选择具有无协同性或负协同性的基于CRBN的PROTAC，观察到了靶蛋白的有效降解。因此，由于三元复合物的多面性，其形成的重要性仍然是经验性的。

鉴于细胞环境的复杂性，监测三元复合物形成，POI泛素化和降解的技术具有很大的优势。利用HaloTag7 - E3连接酶融合蛋白和一个GFP - FKBPF36V的报告系统可以监测PROTACs劫持其它家族的E3连接酶诱导的蛋白质降解。令人兴奋的是，在RING, HECT和RING - in - Between - RING （RBR）E3连接酶中均观察到了GFP - FKBPF36V的降解，揭示了PROTAC对其它家族的E3连接酶的广泛适用性。类似地，dTAG系统可用于评估和验证PROTAC诱导的POI降解的生物学后果，而无需通过监测FKBPF36V的POI融合蛋白的降解来开发POI配体。该技术已被用于: （1）选择性地诱导POI降解，从而将目标与类似亚型区分开来;（2）验证临床前治疗靶点;（3）验证先前确定的疾病进展中的靶点。然而，尽管有这些系统是有用的，但使用这些较大的标签可能会错误地显示E3连接酶、POI泛素化和降解的功效。此外，使用这些方法仍然难以实时监测PROTAC诱导的POI降解的各个步骤（图2）。

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图2 在细胞环境中PROTAC诱导POI降解的步骤

使用CRISPR / Cas9内源标记、发光读数和NanoBRET技术的创新模块化活细胞平台已被开发用于PROTAC诱导的POI降解的功能实时表征。这一新系统允许用于利用CRBN和VHL降解靶蛋白的PROTACs的动力学监测，如HiBiT - BRD2，BRD3，以及BRD4三元复合物的形成、泛素化和降解。例如，用相同的PROTAC处理，尽管所蛋白的降解均到达dMAX>86％，但在不同时间观察到的每个BET蛋白的降解最大水平和回收率都不一样。与三元络合物形成速率和稳定性相比，降解速率和泛素化速率之间存在直接相关性。有趣的是，与HiBiT-BRD4系统相比，异位表达的NLuc - BRD4降解曲线明显不同。降解速率和水平均降低，而恢复速率似乎比内源性标记的HiBiT - BRD4更快。因此，最初使用缺乏实时能力的方法筛选活性化合物，或使用依赖于异位表达的报告系统可能会忽略这几个问题：（1）PROTAC诱导的靶蛋白降解水平；（2）选择性降解POI的可能性；（3）是否可以利用新的E3连接酶。总而言之，像NanoBRET这样的系统可以帮助PROTAC的开发与优化。

三、PROTAC的未来是什么？

虽然，我们已经观察到了PROTAC降解蛋白的强大力量，但PROTAC技术的全部潜力仍有待开发。我们从使用以激酶和BET蛋白为靶点的工具化合物（PROTACs）中学到了很多东西，但这些发现如何转移到其它蛋白质家族或其它类别的蛋白上，仍有待确定。

除了探索其它可被降解的蛋白类型外，我们还必须探索其它E3连接酶的“PROTAC ability”，因为观察到的POI降解差异取决于所利用的E3连接酶。人类蛋白质组中只有<1%的假定E3被成功利用，特别是那些属于RING家族的E3（表1）。我们还没有利用与其它E3连接酶特异结合的小分子配体，如结合U-box，HECT和RBR的E3连接酶的配体。由于降解效率不受与E3连接酶结合的配体的亲和力大小变化的影响，因此，我们可以假设以组织特异性的方式靶向其它E3，而不需要人为的去优化E3配体亲和力。或者，通过探索E3结合配体连接点（表1）和其它对优化三元复几何结构很重要的特征，更有可能做出重大贡献。

能够对活性E2 / E3对进行分类和抑制的技术可鉴定新型E3调节剂。同时，一些E3连接酶通过翻译后修饰，依赖机制被自动抑制。例如，通过GPCR介导的c-SRC激酶活性激活NEDD4-2 （一种HECT型E3连接酶）的磷酸化，从而产生活性。因此，我们可以利用这些激活机制来设计条件性PROTAC诱导靶蛋白的降解。鉴于一些E3连接酶结合病毒蛋白，这种相互作用的特征可以为天然的E3结合配体的设计提供依据。最后，是与N末端互补的降解决定子。最近关于Cullin2-RING连接酶的C末端降解决定子的研究表明，降解决定子可能可以应用到其它E3连接酶家族。正如对VHL所做的那样，我们可以潜在地使用降解决定子来开发新的E3小分子结合配体，从而丰富PROTAC工具箱中“可利用”的E3结合配体来降解靶蛋白。

令人兴奋的是，NanoBiT系统等技术可以表征PROTAC诱导的靶蛋白降解的动态性质（图2）。在占用驱动的药物开发模式中，开发者正努力转向优化候选化合物在靶蛋白上的停留时间（即增加1/kOFF），因为这对于优化药代动力学和药效学药物性质方面是非常有效的。利用现有技术和新技术，我们能够确定哪些关键的动力学步骤是在靶向蛋白降解中应该优化的吗？如果能确定，这些靶蛋白降解依赖E3连接酶的类型吗？

除了表征有效PROTAC所需的基本步骤的动力学特征外（图2），我们还应弄清楚泛素化和降解之间的关系。是否有额外的细胞内体系可以被PROTAC技术利用或加强。例如，P97准备蛋白将E3连接酶（CRBN）标记的底物运输到26S蛋白酶体进行降解。该功能在PROTAC设计中是否应该考虑？此外，降解逃逸机制，如伴侣蛋白和去泛素化酶，也将影响PROTAC降解靶蛋白的效率。

四、展望

这里强调的大多数研究工作表明，我们尚未为PROTAC开发提供即插即用的方法。我们现在可以理解的是，蛋白与配体的亲和力并不代表PROTAC的降解效率。利用成熟的靶蛋白和工具化合物，我们已发现POI泛素化与三元复合物的形成和稳定性对于有效降解非常重要。鉴于这些重要的发现，我们的研究重点应转移到通过探索新的靶蛋白和利用新的E3来扩展PROTAC的广泛用途。与此同时，通过计算、生物化学和细胞学方法来了解甚至预测PROTAC诱导的靶蛋白降解的先进新技术，对于该领域的蓬勃发展至关重要。（分迪科技的PRODED技术已经实现了靶蛋白降解的预测和三元复合物结构的预测。）这些努力将有助于了解PROTAC技术的潜力，并将其真正应用于疾病的治疗。

参考文献

DOI：10.1016/j.cbpa.2019.02.022

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