【PROTAC】新药开发系列（十六）PROTAC前世今生和未来

川大-灰太狼 · 发表于 2019-4-28 09:27:19

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2019年2月13日，Drug Discovery Today：Technologies发表了Craig Crews针对PROTAC技术的最新综述文章。PROTAC的前世今生其实已有综述总结（【PROTAC】新药开发系列（十）2019最新综述）。该文有趣之处在未来和展望，客观地呈现了PROTAC的优势与不足。

一、背景

过去十年，药物靶标领域的格局发生了重大变化。重点已经从传统药物靶标，如G蛋白偶联受体（GPCR），离子通道和激酶转向更具挑战性的“不可成药”靶标。尽管从生物学角度来看传统靶标仍然具有吸引力。这些靶标通常包括无酶功能的蛋白质，如转录因子和支架蛋白。历史上，那些具有明确活性位点，且适合结合小分子的药物靶标，一直是药物干预的重点。因此，针对这些明确活性位点的靶标开发传统小分子抑制剂时现代药物开发的常规方法。所以，目前大多数药物都是小分子抑制剂，主要通过占据驱动的药理学作用模式（MOA）来控制蛋白功能（图1a）。尽管该方法已经成功，但这种MOA不能应用于所有生物靶标，尤其是那些缺乏酶活性的靶标，如支架蛋白或通过蛋白-蛋白相互作用（PPIs）发挥作用的蛋白质。通过药物占用驱动的MOA控制蛋白功能是通过保持高靶标占用率来实现的，而高浓度药物产生的脱靶效应将会导致患者的不良反应。此外，抑制/占据驱动疗法的耐药性已经在许多疾病中被观察到，例如癌症和细菌感染。因此，我们需要努力开发新作用机制的药物，以调节非传统药物靶标和防止耐药性。新作用机制包括，如核酸疗法，修饰的多肽，重组蛋白和单克隆抗体。

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图1 占据驱动和事件驱动的药理学区别

PROteolysisTArgeting嵌合体（PROTACs）分子是一种利用事件驱动的MOA，更是非常有前景的新药开发模式。PROTAC可以通过诱导目标蛋白的降解来调节蛋白水平（图1b）。作为异双功能分子，它由结合目标蛋白（POI）的配体、Linker和E3泛素连接酶（E3）配体组成（图1c）。PROTAC通过与POI和E3形成三元复合物来启动该POI的降解。先是使POI被泛素化标记，然后通过26S蛋白酶体识别并降解多泛素化的POI（图1b）。26S蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统（UPS）的一部分，它是真核细胞调节蛋白质水平的主要机制。在本综述中，所有符合上述定义的化合物将被称为PROTAC。当然，文献中也使用其它名称：如，特异性和非遗传性IAP依赖性蛋白质橡皮擦（SNIPER）、降解剂、degronimids、PROteolysis TArgeting Peptide（PROTAP）、蛋白质降解探针（PDP）。

本综述介绍了PROTAC技术发展过程中的里程及现状，特别关注了2018年年的关键发现，并指明了利用蛋白降解机制开发治疗性新药未来的发展方向。

二、前世

图2展示了PROTAC各阶段发展的里程碑及使用PROTAC技术成功降解的目标蛋白。2001年Crews和Deshaies实验室报告了第一个PROTAC，是利用了含SCFβ-TRCP的E3诱导MetAp-2的降解。接下来的PROTACs分子诱导了AR和ER的降解，从而扩大了可降解目标蛋白的范围。这些PROTACs分子通过显微注射进入细胞，结果显示它们可以在细胞中靶向降解AR和ER。随后的PROTAC则是使用HIF-1α肽片段携带细胞穿透肽序列，以在细胞中利用含VHL的E3降解目标蛋白，无需显微注射（见图1c）。然后，研究者将较短的HIF-1α肽片段作为PROTAC的E3连接端，靶向降解了芳烃受体核转位蛋白（ARNT）。虽然第一代的PROTAC可以诱导目标蛋白的特定降解，但它们仅有低微摩尔的活性。此外，由于它们含肽，故细胞渗透性较差，细胞活性低，这大大限制了PROTAC技术在新药开发中的应用。

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图2 PROTAC技术开发的重要里程碑

PROTAC技术的一项显著进步是发现了特异性结合E3泛素连接酶的小分子。基于小分子的PROTAC在2008年被首次报道。该PROTAC（图1c）利用含MDM2的E3诱导AR的降解，其E3结合配体是MDM2-p53的PPI抑制剂nutlin。该研究证明了透膜PROTAC的开发是可行的，但诱导AR降解的浓度较高（微摩尔级别）。与此同时，研究者发现cIAP1结合bestatin methyl esters可促进其自身泛素化和降解。Hashimoto课题组使用这些bestatins设计了第一个PROTAC，利用cIAP1靶向降解CRABP-I和II。2012年，VHL的高亲和力拟肽配体被发现。随后，Ciulli课题组报道了结合VHL拟肽配体的构效关系研究。同时，Cereblon（CRBN）被鉴定为免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺、泊马度胺和来那度胺的结合靶标。在与CRBN结合后，观察到IMiDs促进目标蛋白，如Ikaros、Aiolos和CK1α的降解。

那时候，还没有发现在体内也具有降解目标蛋白作用的PROTAC分子。直到2013年，研究者设计了第一种在体内可降解目标蛋白的PhosphoPROTACs分子，它们能够抑制小鼠身上人源肿瘤的生长。此外，通过利用受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路的天然特异性，PhosphoPROTACs能够区分不同的RTK信号传导途径。通过接上与目标激酶相结合的磷酸化肽而获得降解不同激酶的选择性。

与VHL结合的小分子配体首先用在了HaloPROTACs上。这些HaloPROTACs由与VHL结合的小分子配体和与HaloTag7（HT7）共价连接的氯代烷烃组成。HT7是一种经修饰的细菌脱卤素酶，与氯代烷烃共价结合。HaloPROTACs成功地利用含VHL的E3以诱导异位表达的绿色荧光蛋白（GFP）-HT7融合蛋白的降解。最有效的HaloPROTAC降解GFP-HT7的最大降效率（Dmax）达到90％，显示出低纳摩尔的降解效果，DC50=19nM。

使用基于小分子配体的PROTAC化合物具有更多类似药物的特性，使其可以高效的透过细胞膜。2015年，Crews课题组与GSK合作，开发了一种降解丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶的靶向PROTAC（见图1C）。该PROTAC一头是结合VHL的小分子配体，另一头则是RIPK2抑制剂，可以选择性地诱导RIPK2降解，且具有低纳摩尔细胞活性（DC50 =1.4nM）。此外，利用体外蛋白泛素化试验证明了PROTAC的催化性质。将其立体异构体，且无法结合VHL的PROTAC分子作为阴性对照，该分子不能降低RIPK2水平，证明了PROTAC是通过利用含VHL的E3连接酶降解RIPK2蛋白的。同时，研究者还报道了使用结合CRBN或VHL的小分子配体靶向BRD/ BET表观遗传蛋白家族的PROTAC（见图1c）。

另一类型的PROTAC是由Astex制药公司开发的In-cell CLIck PROTAC（CLIPTAC）。CLIPTAC是通过生物相容性反应（例如Diels - Alder反应）在细胞内形成PROTAC。依次用细胞可渗透的四嗪取代的沙利度胺衍生物和反式环辛烯取代的目标蛋白配体处理细胞，可形成新的PROTAC降解目标蛋白（BRD4和细胞外信号调节激酶ERK1 / 2）。

总而言之，PROTAC技术将对药物发现产生重大影响。

三、今生

1、已被降解的目标蛋白

迄今为止，研究最多的可被PROTAC降解的目标蛋白是BET和激酶家族，后者包括跨膜RTK和最近的脂质激酶、PI3K。除了这些蛋白质家族外，最近的例子包括Sirt2、HDACs、PCAF和GCN5。在过去的一年里，已经开发出homo - PROTAC用于靶向降解VHL和CRBN。尽管最近开发的大多数PROTAC都使用基于结合E3的小分子，但有一些例子则是使用HIF-1α肽作为与E3结合的部分，用于靶向降解目标蛋白，如：Smad3，Akt，Tau，和Bcl-xL。图2的方框中显示了利用PROTAC技术降解的目标蛋白。

2、降解机制的思考

为了解PROTAC的降解机制，科学家们已经做了大量的研究工作。三元复合物（POI - PROTAC - E3）的形成被科学家们认为是PROTAC降解蛋白的关键（图3）。

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图3 PROTAC降解目标蛋白源自形成稳定的三元复合物

PROTAC诱导目标蛋白降解的机制取决于三元化合物的形成，其能使目标蛋白泛素化，然后被蛋白酶体降解，如前所述（图1b）。目前，已经建立了描述三元复合物形成的数学模型，它们可以应用于PROTAC降解目标蛋白机制的解释。这些模型预测了活性对PROTAC浓度的钟形依赖关系（图3a）。例如，在高PROTAC浓度下，可以观察到非降解性二元复合物的产生，这种现象被称为陷阱效应（图3a）。此外，目标蛋白和E3之间的吸引或排斥作用可能影响三元复合物的形成（图3b）。我们用术语——协同性（α）来描述这些相互作用。当稳定目标蛋白和E3之间的PPI促进三元复合物形成时，发生正协同性（α> 1）。相反 ，当相互作用是消除三元复合物形成时，发生负协同作用（α< 1）。已经证明正协同性可以最小化陷阱效应的程度，从而有助于三元复合物的形成。

Ciulli课题组在2017年报道了第一个三元复合物的晶体结构。该晶体结构是由MZ1、BRD4和VHL构成。其揭示了BRD4和VHL之间的接触，以及PROTAC与BRD4和VHL之间的相互作用。研究者利用各种生物物理方法评估了协同性作用，结果显示，稳定的三元复合物使得PROTAC的降解效率更高，且对BRD家族蛋白具有选择性降解效果。

最近的研究进一步表明，三元复合物的形成可能比目标蛋白配体或PROTAC对目标蛋白的二元亲和力更为重要。基于foretinib的PROTAC对激酶p38α（Kd = 11μM）仅具有较低的二元结合亲和力，但其仍可有效诱导目标蛋白的降解（DC50 = 210 nM，Dmax = 91％）。研究发现，PROTAC介导了在p38α和VHL之间稳定PPI的三元复合物形成，弥补了低二元亲和力的不足，从而诱导目标蛋白的降解。这一发现说明，利用高亲和力目标蛋白配体并不足以获得降解高效的PROTAC。尽管I-BET726（Kd = 4 nM）是较JQ1（Kd = 100nM）与BRD4亲和力更高的配体，但实际上，含JQ1的PROTAC在促进E3诱导的BRD4降解方面更高效，这与通过正协同作用促进三元复合物形成的能力评估结果一致。

然而，也有一些例子表明，正协同性对高效降解似乎并不太重要。如，强效降解BTK（DC50 = 1-40 nM）和BRD4（DC50 = 5-50nM）的PROTACs，两者均利用含CRBN的E3连接酶降解目标蛋白，但试验显示CRBN和目标蛋白之间只有很少甚至没有正协同作用。Gray课题组利用BRD4（BD1和BD2两个溴结构域）、CRBN和PROTAC的三元复合物的晶体结构，并结合生化和细胞数据，在分子水平上对PROTAC介导的三元复合物对降解的影响进行了研究。他们发现，BRD4能与CRBN的C或N末端形成不同的三元复合物，这是因为PROTAC中不同的Linker长度所致。

由于其催化性质，PROTAC被称为泛素连接酶的“可编程基本激活剂”。可编程，指的是PROTAC可以设计为降解任何目标蛋白。基本，则是指必不可少的，因为没有催化反应，即泛素标记，将不会发生蛋白降解。而，激活剂，即活化剂，因为它们以催化方式介导三元复合物的形成。因此，将PROTAC视为激活剂可以为设计更强大的PROTAC奠定基础。

综上所述，三元复合物的形成是研究PROTAC降解目标蛋白的关键因素。上述数据表明，仅仅确定二元目标蛋白与配体或与PROTAC的亲和力可能不足以指导PROTAC的设计。基于目前的数据，三元复合物形成过程中协同性的重要性在不同的E3和目标蛋白之间可能不同，因此很难在分子水平上得到三元复合物相互作用的一般性规律。总的来说，PROTAC的设计旨在获得一个可被高效降解的三元复合物。

3、降解剂与抑制剂的比较

PROTAC分子可以超越现有抑制剂，提供更高的目标蛋白选择性。药物发现中的大量努力是为了发现高选择性抑制剂。目前，虽然有很好的策略可用于开发高选择性抑制剂，但对于高度同源的蛋白质家族，如激酶，它仍然是一个重大挑战。

最近的两项研究表明，与抑制剂相比，PROTAC可以提高同源靶标的选择性。两项研究均使用高度同源的激酶蛋白家族进行研究。Crews课题组从结合约130种激酶的泛激酶抑制剂foretenib（与激酶亲和力均在10 μM以内），结果表明基于foretenib的PROTAC具有高的二元结合选择性，且仅诱导一小部分激酶的降解。此外，基于含VHL和CRBN结合配体的PROTAC，观察到了不同的降解情况。Gray课题组利用泛激酶抑制剂（含2,4-二氨基嘧啶骨架）设计了一种PROTAC。同样，观察到了二元结合与降解谱的差异：含2,4-二氨基嘧啶基的PROTAC可结合190种激酶，但仅诱导MOLM-14或MOLT-4细胞中12或23种激酶的降解。总之，两项研究都得出同样的结论：目标蛋白的降解和与是否和PROTAC高亲和力结合无关。一些对PROTAC显示出高结合亲和力的激酶没有被降解，而一些低亲和力激酶却被降解了，如上述的p38α蛋白。因此，这些研究进一步证明，三元复合物的形成对于PROTAC的开发相当重要。在开发靶向降解TBK1的PROTAC时，也观察到超过目标蛋白抑制剂的高降解选择性。基于TBK1和IKKε的抑制剂（IC50分别为1.3nM和8.7nM），开发了选择性降解TBK1的PROTAC。有趣的是，PROTAC既选择性诱导TBK1的降解，又保留了对TBK1和IKKε的抑制活性。对包括BRD4和BCR-ABL在内的其它靶点以及针对HDACs和FMS，如FLT-3的PROTAC的最新研究实例也观察到了类似的高选择性。

此外，PROTAC的Linker长度以及Linker的连接点可影响选择性和降解特性。在最近的一项研究中，研究者发现三元复合物的构象依赖于结合BRD4和CRBN的PROTAC中Linker的长度。这表明具有相同E3结合配体和目标蛋白结合配体的PROTAC可根据Linker的连接点和Linker的化学组成的差异，提供不同的选择性。此外，Linker长度也影响降解：3个原子的Linker长度的增加会改变基于拉帕替尼的PROTAC的降解特性，从降解EGFR和HER2转变为仅选择性降解EGFR，而非HER2。因此，PROTAC技术可以增加一个比抑制剂更高维度的选择性，这进一步增强了其作为开发新型治疗剂策略的潜力。

过去的一年的研究表明，事件驱动的PROTAC可以避免抑制剂的耐药性，包括靶蛋白过表达和抗性突变。

对于抑制剂机体常见的耐药性机制是靶蛋白的突变，如抑制剂结合口袋氨基酸残基的突变，其使得抑制低效或无效。例如，当依鲁替尼用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时，可以观察到这一点，因为CLL的治疗效果取决于BTK的活性。依鲁替尼是一种不可逆的激酶抑制剂，其与BTK上ATP结合位点的半胱氨酸共价结合。超过80％的CLL患者由于半胱氨酸-丝氨酸突变（C481S）而对依鲁替尼产生耐药性。然而，基于不能与BTK共价结合的依鲁替尼衍生物开发的降解BTK的PROTAC可以诱导BTK野生型和突变体（C418S）的降解。最近的其它研究也报道了成功降解BTK的PROTAC。

PROTAC还可以避免由抑制剂导致的其它耐药机制。恩杂鲁胺是一种用于治疗前列腺癌的AR抑制剂。对恩杂鲁胺治疗产生的耐药性是因为AR的突变将恩杂鲁胺转化为激动剂或内源性雄激素配体，导致AR上调。含恩杂鲁胺衍生部分的PROTAC可成功利用含VHL的E3诱导各种AR突变体的降解。这体现了PROTAC的事件驱动性质。另外，在雄激素存在的情况下，这些PROTAC分子在AR过表达细胞中的抗增殖和促凋亡活性方面优于恩杂鲁胺。

与抑制剂仅能阻断酶功能不同，PROTAC降解激酶既可以调节支架又可以阻断酶功能。最近的一项研究表明，降解RTK的PROTAC能够调节支架功能，并诱导对激酶抑制剂具有耐药性的RTK突变激酶的降解。PROTAC可诱导EGFR、HER2和、c-Met的降解，包括EGFR和c-Met的突变体。这些RTK的消耗导致下游信号传导停止。此外，与抑制剂相比，PROTAC诱导的降解显示出激酶重接的延迟。该研究还首次证明PROTAC能够诱导跨膜受体的降解。同样，PROTAC诱导FAK降解也被证明会影响FAK的支架功能。利用PROTAC降解FAK的效果在Fak信号传导以及细胞迁移和侵袭导致的类三阴性乳腺癌细胞中均优于FAK激酶抑制剂。

另有研究显示，以PCAF和GCN5蛋白（与表观遗传蛋白密切相关）为目标蛋白的PROTAC能够有效调节脂多糖刺激的巨噬细胞和树突状细胞中多种炎症介质的表达。相反，用PCAF和GCN5蛋白的抑制剂占据它们的溴结构域不足以调节这些蛋白质的免疫调节功能。

综上所述，PROTAC技术可以通过提供调节蛋白酶促和非酶促作用的手段，避免使用抑制剂难以或不可能调节的耐药性机制。

四、未来

1、PROTAC的设计、合成与活性

为了简化并加速PROTAC的发现，需把握PROTAC的设计规律，这有助于建立可靠的PROTAC评估平台（图4a）。迄今为止，大多数报道的PROTAC都是基于目标蛋白结合配体（通常是抑制剂）设计的。因为，目标蛋白与其结合配体的晶体复合物结构及其配体的构效关系信息已被用于指导PROTAC设计，如确定目标蛋白结合配体上Linker的连接位置。最近的一个研究是通过使用化合物的物理化学性质来指导PROTAC优化，开发了降解转录因子调节剂pirin蛋白的PROTAC。仅三次迭代，即获得了选择性降解pirin的PROTAC。另外，蛋白-蛋白的对接计算已被用于高选择性降解BRD4的PROTAC的合理设计。

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图4 各种PROTAC降解目标蛋白的机制

研究者通常使用免疫印迹和质谱法等技术来测量蛋白质水平，以筛选具有活性的PROTACs分子。然而，这些技术目前并不适用于高通量筛选，且仅能提供有限的信息来指导PROTAC结构优化。因此，PROTAC的设计和优化主要还是依靠经验，不断地进行PROTAC的迭代设计、化学合成、生物测试和结构分析（图4a）非常费力和耗时。

三元复合物的结合数据以及三元复合物的三维结构将提供有价值的信息，因为它在确定PROTAC功效方面具有公认的重要意义。但，迄今为止仅报道了几种含PROTAC的三元复合物晶体结构。研究三元复合物形成的方法有TR-FRET、AlphaLISA、SPR和ITC。但这些方法却不能展现降解目标蛋白所需的完整泛素-蛋白酶体系统。

最近，Promega开发了一种用实时活细胞系统，用于PROTAC活性评估。该系统能够表征降解功效和MOA（图4b），它将CRISPR / Cas9内源标记与发光技术结合起来动态地测量活细胞中目标蛋白的含量。此外，当这项技术与生物发光共振能量转移（NanoBRET）结合使用时，它能够沿着降解途径（如三元复合物形成，泛素化和PROTAC参与）对细胞内蛋白质相互作用进行动态测量。当研究缺乏酶活性和/或下游信号传导的非传统药物靶标时，该系统可能特别有价值。

2、发现更多E3

根据人类基因组，科学家预测有超过600个E3。但迄今为止，只有少数已被证实或用于PROTAC的开发：特别是含VHL、CRBN、MDM2和cIAP1的E3，因为它们都具与其结合的小分子配体。结合E3的多肽配体也已经取得了一些成功：第一个使用结合E3多肽配体设计的PROTAC成功募集了β-TRCP；一个含有Keap1结合肽的PROTAC能够利用含Keap1的E3诱导Tau蛋白降解。虽然这些E3已被证明是成功的，但也存在一些问题，需在PROTAC设计中加以考虑。首先，最初使用的cIAP1结合配体存在特异性问题，因其能导致自身降解，这限制了该E3的使用。幸运的是，最近的研究表明，只要仔细选择结合cIAP1的配体，则可在很大程度上避免其自身泛素化，从而消除cIAP1的自我降解。最近，也有研究显示，利用含CRBN的E3设计的PROTAC除了降解目标蛋白外，还可同时降解其它蛋白，正如IMiDs所观察到的那样。降解其它蛋白的脱靶效应可能会限制其在PROTAC技术中的应用。因此，控制潜在的CRBN介导的脱靶效应非常重要。研究者已经免疫印迹和阴性对照化合物来确定脱靶蛋白的降解。如果能进行全局蛋白质组学研究以监控被降解的未知目标蛋白，将更加完美。然而，脱靶效应也未必是件坏事，最近的研究显示，可以在PROTAC设计中利用E3结合配体的固有活性。如靶向降解BRD4的PROTAC用nutlin衍生物作为E3结合配位，利用MDM2降解BRD4。结果表明，该PROTAC具有双事件驱动性，即可诱导BRD4的降解又可上调肿瘤抑制因子p53的水平，在几种癌细胞系中具有协同的抗增殖作用。利用结合MDM2配体的这一性质可开发具有低纳摩尔效力的PROTAC。

为了进一步发展PROTAC技术，科学家需要努力确定可以利用的其它E3。最近报道了一种基于细胞的E3报告系统，用于评估哪些E3可被用于诱导目标蛋白降解（图4d）。他们研究了主要的三大类中六种不同的E3。将它们与HT7融合，并设计含FK506“bump”配体的HaloPROTAC来降解FKBPF36V-GFP融合蛋白。六个E3中有两个（Parkin和β-TRCP）可被PROTAC利用。如前所述，β-TRCP已是可以被利用的E3，Parkin则是一个新的可以被利用的E3。

3、选择并验证目标蛋白

目标蛋白的选择是药物发现项目中最重要的决定之一。此外，并非所有生物靶标蛋白都能被降解，正如上所述，PROTAC开发可能是一个非常耗时的过程。因此，对选定的目标蛋白进行早期验证是非常重要的。

在最近的一篇论文中，基于蛋白质组学方法，泛激酶降解的PROTAC被来评估激酶的可降解性。几个特征明确的激酶被确定为能被PROTAC降解。类似的研究可能有助于降解其它蛋白质家族的PROTAC设计有用。此外，包括HaloTag（HT）和His标记的目标蛋白标记系统也可用于确定目标蛋白的可降解性，并同时进行靶标验证（图4c）。该系统已被用于VHL或cIAP1的HaloPROTAC开发。目前，Promega为HT-POI的融合蛋白提供了约9000种商用质粒，非常易于使用。然而，应该注意的是，该系统提供过表达的HT-POI水平，这已经被证明会影响正常蛋白质的转换和体内平衡。不过，这可以通过使用CRISPR/Cas9基因组编辑获得内源水平的HT标记的目标蛋白来克服这个问题。在最近的一个研究中，CRISPR介导的FKBP12F36V的敲入提供了内源表达的FKBP12F36V-POI融合蛋白。这种称为dTAG的系统（图4c）可用于早期目标蛋白的验证。它是一种基于细胞的系统，可以利用CRBN招募PROTAC立即和选择性地降解目标蛋白。dTAG方法已成功用于不同FKBP12F36V标记的目标蛋白，包括BRD4，MYC和KRAS。此外，它还被单独用于评估PROTAC的细胞渗透性，因为PROTAC的高分子量，能否透过细胞膜是一个问题。

4、攻克“不可成药”蛋白

目前，被PROTAC降解的目标蛋白大多数仍然是可药蛋。PROTAC技术有潜力去开发有挑战性的非传统药物靶标的分子。由于PROTAC技术仅需要临时介导三元复合物的形成，因此可将低亲和力的目标蛋白结合配体用于PROTAC分子设计。上文讨论过的降解p38α的PROTAC就证明了这一点，其显示出与目标蛋白的低亲和力（11μM），但却能有效诱导p38α的降解（DC50 = 210 nM，Dmax = 91％）。这使得PROTAC可以降解传统的、基于占据驱动的抑制剂难以有效的目标蛋白。

将结合配体转化为PROTAC的一个实例是开发降解pirin蛋白的PROTAC。pirin蛋白属于cupin超家族，并且没有已知的酶活性或已知的内源配体。为了进一步研究这种蛋白质，基于细胞的表型筛选发现的pirin蛋白结合配体设计了PROTAC。PROTAC成功诱导了pirin蛋白的降解，还与其结合配体竞争性地结合pirin蛋白。PROTAC和小分子探针为进一步研究未探索的pirin蛋白提供了化学工具。这种策略可在传统工具无法成功的情况下，用于研究目标蛋白。

5、进入临床研究

目前，药物的类型已得到了很大的扩展，包括各种替代蛋白。近年来，进入临床的生物制剂，如替代蛋白（胰岛素）或单克隆抗体（如曲妥珠单抗）的数量有所增加，但小分子药物仍然是新药发现中最多的。与生物制剂相比，基于小分子的PROTAC技术的优势在于制造成本。小分子药物每位患者每年花费仅约700美元，而生物制剂则约为15,000美元。PROTAC的用药成本甚至还低于传统小分子药物，因为前者是事件驱动的催化过程，仅需更低用药剂量和更低频率的给药。此外，小分子药物的另一个优点则是它们的细胞通透性，能轻松透膜，然后调节细胞内靶蛋白的功能。

在PROTAC发展的早期阶段，由于它们并不遵守Lipinsk的类药性“五规则”，他因此其口服可用性受到了质疑。尤其是PROTAC的高分子量可能会带来透膜性问题。目前，设计所谓的“超越五规则（bRo5）”化合物的一般原则正在快速发展。事实上，在2017年，阿维纳斯报告了第一个降解AR的口服PROTAC。此外，在小鼠异种移植研究中，该PROTAC诱导AR降解的疗效明显优于对照抑制剂，且在1mg / kg PO QD剂量下观察到90％的AR降解。

如前所述，用化学方法将失败的小分子药物转化为PROTAC可以快速获得新的治疗药物。这对于临床阶段失败的小分子废弃药物的二次开发和利用有特别的价值。

五、展望

科学家不断地扩展药物发现的各种方法。PROTAC技术作为使用事件驱动替代占据驱动的新模式显示出巨大的潜力。本文讨论的研究成果证实了PROTAC展示的事件驱动与占据驱动相比具有几个优势。2018年取得的主要进展包括：增强对同源蛋白质家族的结合和降解选择性，以及避免常规抑制剂耐药性的能力。此外，PROTAC技术显示出在抑制剂不成功的情况下调节目标蛋白功能的潜力。如降解PCAF和GCN5的PROTAC，抑制剂调节对这两种蛋白无效。且结合配体被用于设计降解pirin蛋白的PROTAC的成功显示了PROTAC技术的适用性。此外，PROTAC开发平台正在出现，包括早期目标验证方法和允许三元复合物形成以及目标蛋白降解的细胞内表征的系统（图4）。显然，现有的抑制剂开发技术仍然可使用，但应尽早包括三元复合物形成表征以指导PROTAC优化。由于目标蛋白的低亲和力结合配体可用于PROTAC设计，因此片段药物设计（FBDD）方法可用于发现低亲和力配体。与三元复合物形成分析相结合，可有助于靶向降解非传统药物靶蛋白，特别是针对那些“不可成药”或抑制剂无法成功的蛋白。此外，开发用于预测三元复合物形成的计算工具，以实现高通量虚拟筛选将有助于PROTAC的设计。分迪科技同时拥有FBDD和三元复合预测工具，目前正在利用专有的PRODED开发平台进行基于结构的高通量虚拟筛选及生物测试验证，用以加快新型蛋白降解剂的开发。

由于已经证明E3的选择会影响PROTAC降解曲线，因此还需不断扩展可以使用的E3。另外，利用组织和/或疾病的特异性E3，通过开发仅在特定环境中有活性的PROTAC可以进一步提高选择性，类似于phosphoPROTAC。

目前，还需要进一步的研究来确定体内PROTAC的效果，随着第一批PROTACs分子进入临床试验，这些信息将很快得到。对于PROTAC技术来说，这是一个激动人心的时刻。随着PROTAC开发原则的确立以及可被降解的更多目标蛋白和E3的出现，有关这一极具前景的新药开发策略将随着时间的推移而不断提高。

参考文献

DOI：10.1016/j.ddtec.2019.01.002

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基于前期的成功实践，分迪科技构建了从药物分子设计、合成到生物测活的小分子降解蛋白先导化合物开发整体体系。

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PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列