方兴未艾之时的不可逆蛋白激酶抑制剂

中科院-石头

方兴未艾之时的不可逆蛋白激酶抑制剂

The Resurgence of Irreversible Protein Kinase Inhibitors

不可逆抑制剂并不是一个新的概念，在药物研发历史中发现的不可逆抑制剂有，阿司匹林、青霉素和06年销售量top20的奥美拉唑、氯吡格雷等。在他们被广泛使用和研究后，才发现作用机理是通过体内活性代谢物与靶标形成共价键，不可逆地抑制靶标活性。而且，这一滞后被发现的不可逆机理，也给药物化学家在设计药物分子方面，提供了新的思路，即通过引入活性片段（通常是亲电基团）达到与靶标共价结合的目的，从而提高活性。

在蛋白激酶抑制剂中，这种能与活性片段（warhead）结合的靶标残基有两种：赖氨酸（Lys）和半胱氨酸（Cys），其中，Lys的氨基可以与小分子的易离去基团发生亲核取代反应，Cys的巯基则可以与小分子或发生迈克加成反应或形成二硫键等。（见图1）

图1

不可逆蛋白激酶抑制剂有什么优点呢？最显著的优点就是，对靶标的活性强，一旦药物分子历经口服（或注射），肠壁吸收，首过效应，血浆代谢等重重关卡到达靶标组织与靶蛋白结合后，抑制活性将不再依赖于血药溶度（AUC）、半衰期（t1/2）等药动数据。因为不可逆小分子的结合，将使被结合的靶蛋白永久失去生物功能，而机体只能通过自身新陈代谢重新生成靶蛋白来恢复本身的功能。这样一来，又会带来另一个问题，即毒性问题。因为，一旦药物分子的warhead错误地结合了非靶标蛋白（off-target），将会影响正常的生理功能。带着这个问题，通过后面的例子可以看出解决的思路。

如果按可被共价结合的Cys在蛋白激酶结合口袋的位置分，可以把目前的不可逆蛋白激酶抑制剂分为6类，分别是Group1（P-loop区），Group2（β2折叠区），Group3（铰链域），Group4（β8折叠区），Group5（A-loop区），Group6（Gatekeeper区）。（见图2）

图2

以Group1B中的FGFR抑制剂FIIN-1为例，从图3左边可以看出，落在该区域的靶蛋白有FGFR，YES，Src，YNK1等，如果能够设计一个小分通过与Group1B处的Cys共价作用，不仅能获得高活性分子，而且能达到与其它区域蛋白的选择性（解决off-target问题）。该分子的设计者以FGFR可逆抑制剂PD173074为出发点，通过观察晶体结构，发现在母环朝向Cys484的位置可以引入丙烯酰胺片段（warhead），或许可以找到新的不可逆抑制剂，于是进行了不同的尝试得到化合物1（活性降低300倍）、化合物2（活性增强）、化合物FIIN-1（选择性进一步提高，其实这里基于原来可逆抑制剂的选择性设计策略，也同样能提高不可逆抑制剂的选择性，进而解决off-target问题）。

图3

上面这个例子讲到了，通过提高选择性来解决off-target带来的毒性问题，如果从药物化学的角度来讲，具体的策略有两条：一是通过探索母核结构的多样性，个人认为不同的激酶对某些特定的结构具有选择性（优势结构设计策略），比如EGFR与喹唑啉、嘧啶母核抑制剂匹配，VEGFR与脲类结构匹配，这个母核结构的本质是ATP腺嘌呤结构的生物电子等排。二是通过微调活性片段（warhead），或基于化学知识调整活性片段的反应活性，或采用不同linker来连接warhead和母核。

最后，再抛出一个问题，希望和大家讨论。传统的对接方法对可逆抑制剂比较适用，但是，对于这类不可逆抑制剂与蛋白的结合模式，采用什么计算模拟手段可以预测和评价结合的强弱？

chongju135

共价结合的小分子还是有研究价值的，谢谢楼主分享

风姿花传

學習了  謝謝

xxffliu

shuc.chen 发表于 2013-7-10 09:46

                               
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我觉得思路有点问题：如果先筛选弱活性先导，再修饰骨架，这样不管是后期组装的迈克尔加成受体还是骨架跃 ...

是的，你说的有一定道理，后组装的迈克尔受体的构象和活性都可能会改变，但是并不是全部。只要骨架跃迁的构象合适，是完全可以支持迈克尔受体在与模版相同位置形成所需共价键，我们最近通过虚拟骨架跃迁找到了一个新的激酶抑制剂，根据分子对接指导迈克尔受体组装，所得结构与模版重叠很好，活性测试证明确实形成了共价键。当然也许我们运气好找到了这样一个新骨架，但是也表明这条路并不是完全走不通的。另一方面虽然大部分已知共价抑制剂都是通过筛选得到，但不是虚拟筛选，如你所述，现有对接方法不是真实模拟这个共价作用，所以我怀疑完全基于结构的虚拟筛选成功率估计不会很高。很多文章中也是把可逆抑制剂定向的改成了不可逆的，如最近合肥高场实验室报道的BMX抑制剂。

另外我所指keap1通道可能是表述不当，实际是propeller的中心，即nrf2结合位置，附近有一个cys434。我以为你指的是这个，后来发现你提到的那两个关键残基不在这个结构里。

你想要做的那个恐怕得用量化研究成键过程。

shuc.chen

xxffliu 发表于 2013-7-10 03:54

                               
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先筛选弱活性先导，然后在合适的位置组装迈克尔加成受体。或者直接进行骨架跃迁替换。
keap1那个Cys想得到 ...

我觉得思路有点问题：如果先筛选弱活性先导，再修饰骨架，这样不管是后期组装的迈克尔加成受体还是骨架跃迁都可能极大地影响先导分子的非键作用性质，换句话说就是你修饰完骨架，对于是否有利于发生共价反应的影响是极不确定的，这样倒不如直接筛选。
弱弱地问keap1分子和通道中心有什么关系？下面摘自维基百科
Keap1 has four discrete protein domains. The N-terminal Broad complex, Tramtrack and Bric-à-Brac (BTB) domain contains the Cys151 residue, which one of the important cysteines in stress sensing. The intervening region (IVR) domain contains two critical cysteine residues, Cys273 and Cys288, which are a second group of cysteines important for stress sensing. A double glycine repeat (DGR) and C-terminal region (CTR) domains collaborate to form a β-propeller structure, which is where Keap1 interacts with Nrf2
这个设计keap1的共价小分子抑制剂可以在包含Cys273 和 Cys288的活性区域内筛选的。不知道你的设计区域在哪里？

PS：正如楼主回复的，我现在对于非键相互作用是如何影响成键作用发生的影响是也很感兴趣？我现在就想多找些这样的分子蛋白体系作为研究对象

xxffliu

先筛选弱活性先导，然后在合适的位置组装迈克尔加成受体。或者直接进行骨架跃迁替换。
keap1那个Cys想得到共价小分子抑制剂有点困难，离通道中心太远了，一般小分子的空间取向很难达到要求。

shuc.chen

今天又重温了这个话题，很有意思，我自己很久以前也困惑过这个问题，首先还是要弄明白非相互作用怎么表征？然后从酶催化的分子机理作参考，弄清楚诸如CYS与小分子配体发生化学反应时，非键作用到底是怎么发挥作用的？最后从一系列这种反应机理提取出规律或模型。。。

中科院-石头

shuc.chen 发表于 2012-11-27 09:29

                               
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记得当时筛选能与keap1迈克尔加成反应的小分子配体时，先用了desmond的一个模块，具体名字记不清了，对有迈 ...

现在还没看到比较好的方法来模拟成键作用对接。如果用schrongdinger中的Glide来对接，可以设定迈克受体在半胱氨酸附近出现，但是这个权重不好把握，也就是说，无法估计因共价键结合可能损失的最优非键作用构象。再加上部分蛋白残基的柔性，更增加了不确定性。

shuc.chen

这个是不是可以类比酶的催化反应，这个算是研究的比较久了

shuc.chen

记得当时筛选能与keap1迈克尔加成反应的小分子配体时，先用了desmond的一个模块，具体名字记不清了，对有迈克尔受体双键特征的小分子做了下初筛，然后用autodock虚拟筛选，最后发现小分子的binding energy都是负值，我们当时的推理就是小分子与受体的特定结合口袋要通过非键相互作用结合上去，随后特定的小分子构象，在三维空间的取向上要利于发生共价反应，这个可以通过写些脚本来分析距离吧，当时都没做，体外实验也没做。
值得注意的是几个阳性参照小分子与keap1的结合能都不高，我们推断太高或是太低都不行，应该有个范围
关于非键相互作用与成键相互作用的关系值得探讨

wangqiang306

非常好，围观学习了