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[开发实例] 【PROTAC】新药开发系列(十二)同源选择性降解CDK6

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发表于 2019-3-2 11:23:30 | 显示全部楼层 |阅读模式

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2019年2月21日和25日,哈佛医学院的Nathanael Gray联合Eric Fischer课题组在《CELL CHEM BIOL》和《ANGEW CHEM》上发表了两篇应用PROTACs同源选择性降解CDK6的研究文章。这是第一次报道PROTACs分子实现区分同源蛋白的选择性降解,仅降解CDK6,而非CDK4。
有趣的事:
我们利用分迪科技的蛋白降解小分子新药开发平台(PRODED)在去年7月预测了含CRBN的E3体系如何选择性区分CDK4和6。并在我们的蛋白降解“小讲堂”中提出了E3泛素化标记可以实现比以往抑制剂分子更高的立体选择性,从而有效避免脱靶效应。

1摘要

选择性小分子的设计经常受到配体结合口袋类似性的阻碍。这里,我们报告一种名为BSJ-03-123的PROTAC分子,利用差异三元复合物形成因素,在蛋白质组范围内实现选择性降解细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6),且可区分CDK4。另外,研究工作还论证了降解CDK6对急性髓性白血病细胞的抑制作用,并且从转录组学和磷酸化蛋白质组学分析了快速降解CDK6对协调信号传导和转录的直接影响。

                               
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2介绍

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)协调细胞周期和转录。CDK是丝氨酸/苏氨酸激酶,它们的活性依赖于与细胞周期蛋白的结合,能够对酶功能进行时间控制。CDK4和CDK6通过与D型细胞周期蛋白结合来磷酸化抑制视网膜母细胞瘤基因(Rb)来控制G1-S转换。这减轻了Rb介导的E2F转录因子(TFs)的抑制,从而触发S期所需基因的表达。虽然长期以来认为CDK4和6是赘余的,但最近的研究已经确定了二者的同源特异性功能。特别是,CDK6被认为是连接细胞周期与代谢的调节中枢。某些情况,CDK6的转录作用与其激酶功能无关,而是依赖于分子支架。
CDK4/6的ATP竞争性抑制剂已显示出显著的临床活性,目前已获批了三种CDK4/6抑制剂用于治疗乳腺癌。然而,这些抑制剂都不能区分CDK4和6,因为它们结合的ATP结合口袋的氨基酸序列有94%的序列一致性。此外,目前的抑制剂不能破坏脚手架功能。为了解决这个问题,我们转向基于PROTAC诱导靶蛋白降解的策略。该技术可诱导目标蛋白(POI)被含CRBN的E3连接酶泛素化标记,从而被蛋白酶体降解。有趣的是,多激酶结合抑制剂作为接头的PROTAC并没有降解全部的激酶,只选择性了部分激酶,这表明我们可以选择性地降解目标蛋白。沿着这些方向,研究者证明了利用POI-E3界面中的氨基酸差异从而实现差异性三元复合物形成,可以实现选择性降解目标蛋白。
这里,我们探讨了使用结合两种酶ATP位点的配体设计PROTAC,选择性降解CDK4与6的可行性。我们设计了名为BSJ-03-123(BSJ)的PROTAC分子。试验证明BSJ选择性降解CDK6。将快速降解CDK6与磷酸化蛋白质组学和转录组学分析相结合,我们利用急性髓性白血病(AML)细胞帮助理解BSJ选择性降解CDK6的机制,并绘制了CDK6依赖性信号传导事件的网络图。

3结果

3.1、设计选择性降解CDK6PROTAC
我们选择帕博西尼作为PROTAC的一端,因为它具有高选择性与活性。CDK6与帕博西尼的晶体复合物(PDB:5L2I?)显示出哌嗪部分暴露在溶剂中,是连接Linker的好位点。我们将其与泊马度胺用聚乙二醇Linker连接起来,得到化合物YKL-06-102(YKL)(图1A)。试验表明YKL与CDK4和CDK6的亲和力有微弱的减少,与重组CRBN-DDB1的亲和力与泊马度胺相当。用YKL进行的细胞处理导致CDK6的选择性降解。我们采用细胞处理后的全局蛋白质组学进一步研究了降解的选择性。实验结果显示,虽然YKL选择性降解CDK6,但也同时降解了IKZF1和3,这可能是由结合CRBN的泊马度胺部分导致的。为了去除YKL对IKZF1和3的降解活性,我们将泊马度胺连接Linker的-NH-改为-O-,但不改变初始Linker长度,命名为BSJ。体外与重组激酶结构域结合的测量(KINOMEScan)证实BSJ有效、快速地选择性降解CDK6。蛋白质组学研究表明BSJ仅降解CDK6而不降解IKZF1和3及其它蛋白。

                               
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图1 降解CDK6的PROTAC设计

基于BSJ,我们进一步合成了在体外不能结合CRBN的N-甲基化戊二酰亚胺类似物(BSJ-bump)(图1H)。BSJ-bump不能降解CDK4或CDK6,因此作为BSJ活性的阴性对照(图11)。
3.2、差异三元复合物导致CDK6选择性降解
接下来,我们试图了解CDK6选择性的机制。体外激酶测定证实BSJ对两种激酶均具有一定的亲和力。CDK4/6的类似细胞热稳定性进一步表明,差异细胞靶标参与不会产生选择性(图2A)。因此,我们假设选择性可能源于差异三元复合物的形成。为了在完整细胞中实时监测三元复合物的形成,我们设计了基于NanoBiT技术的荧光素酶互补测定试验(图2B)。我们在表达CRBN的293T细胞中表达了C末端CDK4/6LgBit融合蛋白以及N末端SmBit-CRBN融合蛋白。BSJ连接CDK6和CRBN,诱导快速的剂量依赖性的三元复合物形成,但不与CDK4和CRBN形成三元复合物(图2C)。BSJ-bump不能诱导CDK6与CRBN相互作用(图2C)。另外,通过用泊马度胺或来那度胺预处理来阻断CDK6与CRBN的结合来防止三元复合物的形成(图2D)。因此,我们得出结论,BSJ利用CDK4和CDK6之间的结构差异,通过差异三元复合物的形成实现CDK6的选择性降解。

                               
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图2 差异三元复合物的形成导致BSJ选择性降解CDK6
3.3、利用BSJ选择性降解CDK6验证细胞对蛋白的依赖关系
为了论证CDK4不是CDK6富集细胞依赖的重要蛋白,我们转向342个癌细胞系中的基因组规模的CRISPR/Cas9筛选。我们在CDK6依赖模型中鉴定出AML细胞系的显着富集(图3A)。这些细胞系中没有一个显示出对CDK4的依赖性。与基因表达数据的交叉并没有揭示本质性和mRNA转录水平之间的相关性。因此,CRISPR/Cas9介导的AML细胞系MV4-11细胞中CDK4的遗传耗竭揭示了细胞的生长动力学和细胞周期分布,结论支持CDK4在AML细胞系的增殖中可有可无。

                               
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图3 利用BSJ验证细胞对蛋白的依赖关系
CDK4/6抑制剂由于缺乏4和6的选择性,无法选择性降解CDK4和6。因此,抑制剂的治疗窗口会受限。我们想测试BSJ是否可以抑制依赖CDK6的AML细胞,但对CDK4依赖性癌细胞系无抑制作用。如所预期的,CDK4/6抑制阻止了CDK4依赖性细胞系的增殖,而选择性降解CDK6不会引发同样的效果(图3B)。相反,在CDK6依赖的AML细胞系中,BSJ通过诱导G1细胞周期停滞没有明显的细胞凋亡作用,但引起了显著的抗增殖作用(图3C-3E)。值得注意的是,这种作用超过给与细胞BSJ-bump的抗增殖效果(图3C)。我们观察到降解CDK6优于抑制CDK6的益处可能是由于其它激酶活性非依赖性分子机制的破坏而致,或者由于降解物的药理学优势,如催化靶转换。为了解决这个问题,我们比较了BSJ和帕博西尼在CDK4缺陷的MV4-11细胞中的作用,作为降解CDK6效果的参考。在该实验中,CDK6的选择性降解不优于酶抑制(图3F)。尽管考虑到分子间的物理化学差异,对这一比较的解释并不简单,但它表明AML细胞对CDK6的依赖性主要取决于其激酶功能。
3.4CDK6降解后选择性调控网络的损伤
接下来我们研究了药物对已知的CDK4/6RB磷酸化位点S780的影响。实验显示,BSJ和帕博西尼均能降低P-S780水平(图4A)。值得注意的是,BSJ-bump处理未能影响Rb的磷酸化,表明在所测定的浓度下,对CDK4/6的抑制作用不显著(图4A)。仅在剂量递增时观察到BSJ-bump的可测量影响。与此一致,当敲除CRBN后,BSJ处理对Rb磷酸化无影响。

                               
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图4 降解CDK6对细胞信号转导的影响

鉴于CDK6的多功能,我们在全局范围内进行了分析,以确定快速和选择性降解CDK6将如何影响AML中的细胞信号转导和基因活性。我们用BSJ与帕博西尼进行了比较。首先,我们将快速给药(2小时,每个200nM)与定量(Ser/Thr)磷酸化蛋白质组学相结合,检测了总共22,804个磷酸肽。先用帕博西尼处理,再用BSJ(44up,153down)和191去调节(57up,134down)磷酸肽,结果显示,药物对这197种去调节的磷酸肽影响不大(图4B)。基于激酶-底物富集分析(图4B),改变的位点富集了CDK基序,验证了短期给药偏向上游事件。磷酸化位点改变的蛋白质富含已知的细胞周期进展调节因子。此外,我们的数据表明,与先前报道的基于体外测定的CDK4/6底物显著重叠,但也发现了未描述的底物,如剪接因子SRRM2和RSF染色质重塑组分RSF1。
同时,我们比较了帕博西尼和BSJ引起的转录反应。这使我们能够确定CDK6是否能够独立于其激酶结构域控制转录。正如预期的那样,由于对IKZF1和IKZF3的脱靶效应,YKL的转录影响与BSJ和帕博西尼显着不同。而CDK4/6抑制和CDK6降解产生非常相似且高度相关的转录反应,我们认为CDK6在AML中的转录作用主要限于其激酶功能。为了进一步探索快速降解CDK6的功能意义,我们对CDK6降解和CDK4/6抑制引起的转录变化进行了基因本体术语分析(图4D)。试验显示,转录结果相似,这表明两者都聚集在已知的途径上,例如细胞周期调节,但也影响DNA复制,DNA损伤反应或染色质组织等过程。
为了获得对CDK6功能的完整理解,我们将转录和磷酸化蛋白质组学分析的数据浓缩,得到了快速降解CDK6后改变的磷酸肽为中心的蛋白质网络(图4E)。基于检测到的磷酸肽中共有CDK磷酸化基序(SP/TP)的存在来划分蛋白质。接下来,我们通过向来自实验衍生网络的成员添加具有已建立的蛋白-蛋白相互作用的ENCODE转录调节剂来扩展该网络。网络扩展仅限于可用的全基因组结合数据。计算CDK6耗尽后的动态转录变化,并将改变的靶基因分配给网络驻留的TF,其基于动态调节的靶基因的百分比在视觉上缩放(图4E)。该集成网络允许识别已知的共识下游信号轴,例如Rb-E2F1,还允许识别之前没有与CDK6相关联的节点,诸如BCL11A和NCOR2。网络拓扑在BSJ和帕博西尼给药之间大部分重叠,再次证明:在AML中CDK6主要通过其激酶功能协调信号传导和基因控制。

4讨论

鉴于底物或辅因子结合位点的结构相似性,高选择性小分子的开发是药物发现中的长期挑战。这也是ATP竞争性激酶抑制剂的关注重点,其中缺乏选择性可能产生严重的毒副作用,从而限制了其治疗窗口。我们设计的BSJ可选择性降解CDK6。因为,BSJ通过与CDK6和E3形成差异三元复合物从而具有在蛋白质组范围的选择性。而且,BSJ的这种选择性超越了CDK4/6抑制剂,可区分CDK4和6。特别地,试验显示BSJ仅对依赖CDK6的AML细胞有作用,因此选择性降解CDK6可以降低总体毒性。BSJ诱导CDK6快速而有效的降解使我们能够绘制库快速降解CDK6对下游信号传导网络和转录程序的全局影响。虽然我们不能排除在饱和浓度下,BSJ也抑制CDK4,但在设定的浓度下没有检测到抑制作用。降解CDK6和抑制CDK4/6的比较分析表明,在AML细胞中,CDK6主要通过其激酶活性协调了信号传导和基因活性。我们的分析还揭示了之前未与CDK6相关的几个信号节点和转录中心,如BCL11A和NCOR2,这对于探索这些途径在AML及其它方面的功能相关性至关重要。CDK6在其它恶性肿瘤以及造血干细胞和白血病干细胞中具有突出的作用。选择性降解CDK6将有助于区分相关的分子机制,并进一步解释激酶依赖性和非依赖性功能。未来的药物化学工作将有必要扩大我们所提出的概念,并开发一个选择性降解剂工具箱,以在前所未有的精度和动力学分辨率下研究蛋白激酶的作用。

5意义

传统上,药物发现工作集中于开发小分子抑制剂,其阻断可接近的疏水口袋,例如底物或辅因子结合位点。然而,由于这些口袋通常具有高序列保守性,选择性抑制剂的设计仍然是一个巨大的挑战。这里,我们报告了一种降解剂,它利用配体结合口袋外的结构差异来诱导差异三元复合物的形成,并仅降解CDK6,而不是CDK4。我们采用这种精确的选择性分子BSJ来剖析AML中CDK6依赖的信号传导和基因表达,试验表明它允许对遗传定义的依赖性进行前所未有的利用。这项工作展示了一种工程选择性小分子探针的框架,并为开发在高动力学分辨率下理解蛋白质功能的工具铺平了道路。

参考文献
doi: 10.1016/j.chembiol.2018.11.006

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发表于 2019-3-22 09:33:22 | 显示全部楼层
选择合适的靶点是PROTAC技术的关键
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