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[开发实例] 【PROTAC】新药开发系列(十一)降解CDK4/6蛋白

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发表于 2019-3-2 11:22:11 | 显示全部楼层 |阅读模式

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2019年2月13日,Texas A & M University化学系Kevin Burgess课题组在《Chemical Communications》上发表了一篇应用PROTACs降解CDK4/6的研究文章。这是第一次报道CDK4/6被含CRBN的E3体系降解。同时,还有一个研究组也发表了一篇更令人兴奋的文章,他们设计的PROTACs分子可以选择性降解CDK6,而非CDK4,这是抑制剂无法做到的,敬请期待下周我们的微信文章。
有趣的事:
我们利用分迪科技的蛋白降解小分子新药开发平台(PRODED)在去年7月就预测了含CRBN的E3体系可降解CDK4/6。

1摘要

研究者基于两种FDA已批准的CDK4/6抑制剂设计了两类PROTACs。基于Palbociclib的PROTAC能有效地降解CDK4和6,并抑制视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的磷酸化,使得细胞周期停滞。并且,这些PROTACs仅在纳摩尔浓度下就具有降解蛋白的活性。

2背景

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)对细胞周期调节至关重要。癌症中的细胞周期停滞可抑制肿瘤生长和转移,因此抑制CDK是一个热门的研究领域。第一代CDK抑制剂在该系列的不同成员之间几乎没有或没有选择性,因此并未成药。直到第一种选择性CDK4/6抑制剂的出现彻底改变了该研究领域。2015年,Palbociclib(IBRANCE®)获得美国联邦药品管理局的加速批准,用于雌激素受体阳性,HER2阴性晚期乳腺癌的联合治疗。第二种选择性CDK4/6抑制剂Ribociclib(KISQALI®)于2017年被批准用于治疗上述相同的适应症。截至目前,Palbociclib和Ribociclib至少有20项正在进行的临床试验,用于治疗乳腺转移,肺癌(非小细胞)前列腺癌,胰腺癌和脑癌(胶质母细胞瘤)。因此,我们非常期望这些药物获批用于治疗其它癌症。
Palbociclib和Ribociclib均选择性地抑制CDK4和6。CDK4/6在细胞周期的G1-S期是很重要的,因为它们诱导Rb蛋白磷酸化的一系列事件。阻止Rb磷酸化导致细胞发育停滞,其效果在化疗中已被证明。
PROTACs是两个分子的嵌合体:一个结合靶向泛素化的蛋白质,另一个与E3泛素连接酶特异性识别。这些嵌合体可以强制靶蛋白和E3连接酶接近,从而引发靶蛋白的泛素化,然后利用蛋白酶体降解靶蛋白。PROTACs一个引人注目的特征是:它们在细胞中诱导泛素化的催化作用。因此,它们甚至比使用抑制剂更有效。
PROTAC的机制不同于激酶抑制,因为它们可完全破坏蛋白。最近,已有报道降解CDK8和9的PROTACs分子。这促使研究者开展了基于Palbociclib和Ribociclib的PROTACs研究(图1a)。图1b和c显示了其分别与CDK6的晶体复合物结合模式。这两种CDK抑制剂都的哌嗪-N都暴露在溶剂中,于是研究者假设该位点适合接出Linker与E3连接酶配体连接。我们将结合CRBN的Pomalidomide与Palbociclib和Ribociclib分别用Linker连接起来,形成新的PROTAC,并测定它们对CDK4/6的降解和抑制Rb磷酸化的效果。

                               
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图1  PROTAC 降解CDK4/6的示意图和CDK6复合物

3结果

实际上,该研究的PROTAC是通过将来自Pomalidomide 的已知叠氮化物与Palbociclib或Ribociclib的N-炔丙基衍生物连接起来制备的,如方案1中所示。

                               
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方案1 PROTACs的合成方案
研究者在MDA-MB-231三阴性(雌激素受体,孕酮受体和HER2阴性)乳腺癌细胞系中检测了这两种PROTACs(pal-pom和rib-pom)的蛋白降解效果。如图2a和b所示,与MDA-MB-231细胞共孵18小时,pal-pom剂量依赖性地耗尽CDK4和CDK6,但rib-pom的消耗程度不是线性的。此外,pal-pom和rib-pom降解CDK4的效果优于CDK6,DC50(50%蛋白质降解的浓度)分别为~15和~100nM(图2c和d)。细心的读者可能会注意到图2a和b中显示,用两种CDK4/6抑制剂处理细胞,反而使细胞中的CDK4/6水平提高。研究者尚不清楚导致这种现象的原因,但似乎细胞在某种程度上开启了反馈调节机制,用以弥补CDK4/6被抑制。实验显示,PROTACs降解CDK4/6的效果受Linker长度的影响。研究者用稍短的Linker合成的pal-pom和rib-pom没有发现其蛋白降解效果。由于pal-pom诱导的降解比rib-pom更有效,因此该研究接下来的部分仅关注pal-pom及其衍生物。

                               
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图2 降解MDA-MB-231细胞系中的CDK4/6

视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的磷酸化受CDK4和CDK6的调节。因此,这些细胞周期蛋白依赖性激酶的消耗应该降低磷酸化Rb的水平。图2a和b中的WB实验显示,PROTACs确实以剂量依赖性方式降低Rb的磷酸化。研究表明,用100nM的 pal-pom处理相同的三阴性乳腺癌细胞系,4小时后产生最佳的CDK4降解,而CDK6的最佳降解时间至少需6小时(图3)。更高浓度PROTAC(300nM的 pal-pom)可以加速CDK4和CDK6在细胞中的降解。

                               
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图3 降解CDK4/6的动力学

研究者又进行以下试验以证实pal-pom通过泛素-蛋白酶体途径降解CDK4/6(图4a)。首先,使用10μM的Palbociclib和Pomalidomide分别与pal-pom竞争性结合CDK4/6和CRBN。试验显示,CDK4/6和CRBN位点被过量的抑制剂竞争性占据,使PROTAC无效。接下来,观察到用Palbociclib预处理提高了CDK4/6的表达水平。另一个试验,研究者添加了NEDD8抑制剂MLN4924(1μM),结果显示其阻止了Cullin-RING连接酶的激活,导致含CRBN的E3无法发俗话标记CDK4/6。用MLN4924预处理同时引起了CDK4表达水平的增加,类似于用Palbociclib的预处理。最后,研究者用20μM的蛋白酶体抑制剂MG-132预处理细胞。这种情况下,与用0.1%DMSO预处理的样品相比,大多数CDK4/6在PROTAC处理18小时后仍然存在。该结果表明PROTAC(pal-pom)的确是通过泛素-蛋白酶体途径降解CDK4/6。

                               
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图4 通过泛素-蛋白酶体途径降解CDK4/6

催化作用是PROTACs的一个重要特征,但要证明这一点很困难。一个指标是,细胞活性实验中PROTACs的DC50是否低于其与结合靶蛋白的离解常数(Kd)。这可用KINOMEscan™测量pal-pom与CDK4和6结合的Kd值。KINOMEscan™通过组合DNA标记激酶,固定化配体和测试化合物进行。它是一种竞争性结合试验,具有固定的活性位点定向配体,其中测试样品与固定化配体竞争的能力通过 DNA标记激酶的定量PCR 测量(表1)。结果显示,pal-pom对CDK4/6的DC50值(从图2推导)确实低于激酶结合pal-pom的Kd值,表明降解是催化的。另外,CDK4/6抑制剂与激酶结合的Kd值小于相应PROTAC 的Kd值。
表1 CDK4/6抑制剂和PROTACs的Kd和DC50值的比较

                               
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激酶抑制剂如Palbociclib和Ribociclib是诱导细胞凋亡而非细胞毒性。pal-pom和rib-pom对MDA-MB-231细胞的毒性是适度的(IC50估计在10-50μM范围),但这些化合物的溶解性限制了其定量。

4讨论

上述工作是使用三阴性乳腺癌细胞系进行的,而不是FDA批准的雌激素受体阳性和HER2阴性乳腺癌细胞。为了进一步研究这些PROTACs的作用,研究者对MCF-7乳腺癌细胞进行了类似的试验,这些细胞是雌激素受体阳性和HER2阴性的。结果显示,PROTAC( pal-pom)对该细胞中CDK4/6的降解和细胞毒性不如对MDA-MB-231细胞那样有效。然而,它确实可以长时间抑制MCF-7细胞增殖(最多6天)。这一观察结果促使研究者尝试一种完全不同类型癌症的细胞系:胶质母细胞瘤U87细胞系。结果表明,20-200nM的pal-pom和rib-pom都显著消耗了该细胞系中的CDK4。
综上所述,研究者第一次报告了可以降解CDK4/6的PROTACs。这一发现比降解CDK8/9更为重要,因为只有CDK4/6是有效的癌症靶点。这里的PROTACs含有FDA批准的激酶抑制剂。此外,pal-pom(DC50为20-50nm)的蛋白降解能力明显高于报道的降解CDK8和9的PROTACs。为了进一步校准,表S1还总结了其它完全不同的激酶和相关蛋白上的PROTACs的DC50用以这支持研究者的观点,即本文报道的化合物相对有效。最后,研究者观察到pal-pom和rib-pom在U87胶质母细胞瘤细胞中的活性,预示该PROTACs在其它癌症中的应用前景。

参考文献
doi: 10.1016/j.chembiol.2018.11.006

【分迪科技 PRODED践行者】

基于前期的成功实践,分迪科技构建了从药物分子设计、合成到生物测活的小分子降解蛋白先导化合物开发整体体系。

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