【PROTAC】新药开发系列（十）2019最新综述

川大-灰太狼 · 发表于 2019-3-2 10:45:54

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2019年1月2日，清华大学医学院基础医学系的王银银在《CellBiochemistry andFunction》上发表了一篇关于PROTACs的综述。作者从Pubmed中检索了2001-2018年发表的关于PROTAC的文章，根据30多篇评论文章和80篇研究论文撰总结了PROTACs技术的发展历程。

亮点：

1、按时间先后顺序较为完整地总结了已发表的PROTACs；

2、将PROTACs的研究进展分类，从早期肽类到现在小分子；

3、总结了PROTACs可降解的致癌蛋白，并对其分类；

4、将现有PROTACs按照靶蛋白结合配体和E3作用部分归类；

不足：

1、文章有多处单词拼写错误；

2、文章逻辑不够清晰；

3、文章的部分英文表述存在问题。

1摘要

近年，一种称为PROTAC的新技术发展迅速。PROTACs利用Linker将靶蛋白抑制剂与E3泛素连接酶配体连接起来，以特异性诱导靶蛋白泛素化标记，通过蛋白酶体途径降解靶蛋白。起初的10年，有三个研究组致力于这项技术的开发。目前，该技术已被不同的研究组扩展，旨在开发针对包括癌症在内的各种疾病的新药。本综述总结了各研究组的PROTACs。

2背景

使用药物治疗癌症的策略包括利用抗体、siRNA和小分子以阻断致癌蛋白的活性。抗体具有非常高的特异性，但细胞渗透性不好。siRNA抑制基因表达是一种新策略，但是难递送和脱靶的问题阻碍了其应用。小分子抑制剂被广泛合成，用以阻断靶蛋白活性。但是，小分子药物容易产生耐药性，在某些特殊情况下，抑制剂甚至会导致蛋白质的不停表达并积累。此外，对于某些蛋白质如Ras，在肿瘤发生过程中具有关键突变，由于其表面缺乏成药位点，未能开发出小分子抑制剂。于是，一些研究者试图靶向蛋白-蛋白相互作用的位点，以开发Ras的小分子抑制剂。近年来，PROTACs诱导靶蛋白降解的新策略突飞猛进，成为很有希望的新药开发技术之一。

PROTAC技术是利用泛素-蛋白酶系统靶向靶蛋白并诱导其在细胞中的降解。泛素-蛋白酶体系统的正常生理功能是负责清除细胞中变性，突变或有害的蛋白质。目前，PROTAC技术可降解多种靶蛋白，包括转录因子、骨架蛋白、酶和调节蛋白。由于PROTACs诱导靶蛋白降解的高效，这项技术已经引起从癌症到神经元疾病不同领域的众多科研人员的高度重视。许多研究表明，降解致癌蛋白比抑制它展现的抗癌活性更好。作者根据Pubmed上2001-2018年已发表的30多篇评论和80篇研究论文撰写了本综述（图1）。

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图1 2001-2018年关于PROTAC文章统计图

格尔德霉素是一种天然产物苯并喹啉安那霉素类抗生素，但其毒性较大，因为它结合HSP90，是许多蛋白质，包括雌激素受体（ER）的分子伴侣。几个研究小组观察到格尔德霉素能迅速诱导许多蛋白质的降解，包括ER，HER-2，Raf-1，IGFR1R，突变的v-Src，Brc-Abl和p53。为了降低格尔德霉素毒性，研究者将其与雌二醇分子连接起来，以便能够特异性地靶向降解ER。类似地，格尔德霉素被连接到睾酮用于靶向降解雄激素受体（AR）。这些研究最早提出了能够介导靶蛋白特异性降解嵌合分子的概念。后来，研究者使用SCF蛋白，即多聚体E3泛素化蛋白连接酶复合物。2000年，Zhou等人使用酵母和人骨肉瘤SARS-2细胞表达了SCFE3泛素连接酶复合物。这些前期的探索于努力为KyungboKim, Frank Mercurio, and Craig M.Crews等在2001年和2003年创造PROTAC奠定了基础。在接下来的10中，由RaymondJ. Desharies, Kathleen M. Sakamoto, Kyungbo Kim, and Craig M.Crews领导的研究组主导了PROTAC这项新技术的发展（图2）。本综述旨在总结PROTAC自开发以来的应用。

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图2 PROTACs降解蛋白的历程图

3第一代PROTACs

KathleenM.Sakamoto研究组报道了第一个PROTAC双功能嵌合分子。该研究组将IκB-α磷酸肽和Ovalicin连接形成PROTAC。Ovalicin共价结合MetAP-2，磷酸肽可被SFC复合物（β-TRCP）特异性识别。结果显示MetAP-2与SCF复合物（β-TRCP）连接并且被泛素化标记，最后通过蛋白酶体降解。不久之后，该组继续利用这一概念设计了新的PROTACs以靶向ER和AR。这些分子由E2和DHT与10-aa的IκB-α肽连接而成，证实在蛋白和细胞试验中均可降解ER和AR。这些先驱研究开启了基于肽的PROTACs时代（图3）。

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图3 基于肽的PROTAC分子示意图

在对ER和AR进行研究后，Montrose研究组使用基于肽的PROTACs靶向降解HBV的X蛋白。X蛋白对于病毒复制是必需的，其含有154个氨基酸。慢性HBV感染是引起肝细胞癌（HCC）的主要风险。研究者利用可穿透细胞的多聚精氨酸肽（CPP），使得PROTAC可渗透细胞膜。试验结构表明，基于CPP的PROTAC有效地破坏了HepG2细胞中的X蛋白。

Crews研究组继续使用FKBP12配体和DHT设计PROTACs以靶向降解细胞中的FKBP12和AR。与此同时，Kim研究组利用HIF-1α作用在VHL蛋白上的八肽 (Met‐Leu‐Ala‐ProOH‐Tyr‐Ile‐Pro‐Met) 与雌二醇用Linker连接起来，设计了新的PROTAC。试验证明该在活细胞中PROTAC成功靶向降解ER。随后还证实该PROTAC靶向降解ER，且能够在三维血管生成发芽测定中抑制内皮细胞的分化。接下来，Kim研究组使用天然产物芹菜素（apigenin）来设计新的PROTAC，E3泛素连接酶识别部分则用H2N‐Leu‐La‐ProOH‐Tyr‐Il2‐OBn。试验证明这种基于芹菜素的PROTAC有效降解活细胞中的芳烃受体（AHR）。

除了使用E3泛素连接酶进行泛素介导的蛋白酶体降解外，Bauer等人随后采用分子伴侣介导的自噬（CMA）。通过将五肽（KFERQ）与两种不同的HSP70结合基序连接，可降解突变的亨廷顿蛋白。后来，Fan等人利用CMA设计了降解DAPK1，支架蛋白PSD-95和α-突触核蛋白的PROTACs。这些PROTACs将识别自噬系统的五肽和含有细胞膜穿透结构域（CMPD）的接头，与用于识别靶蛋白的肽连接起来。试验证实，这种多肽不仅在培养的细胞中，而且在大鼠的脑中均有效地敲除了靶蛋白，连接CMPD使得肽类PROTACs可透过质膜和血脑屏障。

为了探究基于肽的PROTACs的生物学功能，Crews研究组将他们设计的PROTACs靶向降解ER的命名为Protac-B，降解AR的命名为Protac-A。有趣的是，这两种PROTACs对降解AR和ER表现出很高的选择性，Protac-A和Protac-B都不影响缺乏ERα和AR细胞的增殖。Tang等人后来证明DHT-PROTAC在LNCaP细胞中促进AR降解。他们研究降解对雄激素敏感的前列腺癌细胞中的AR对细胞增殖和生存力的影响。正如所料，DHT-PROTAC专门抑制雄激素阳性细胞。研究组设计了基于肽的PROTAC用于降解ERα，并在MCF-7小鼠异种移植模型中进进行了验证。

然而，这些基于肽的PROTAC的活性很低，只有微摩尔级别。主要原因可能是细胞通透性差。基于肽的PROTAC，例如靶向降解Tau的PROTAC，由于添加了CPP（D-Arg8-9），因此能够转运到细胞中。这些基于肽的PROTACs的另一个问题是这些多肽分子可能会产生免疫原性，这可能会限制其临床应用。幸运的是，研究者不断尝试改进基于肽的PROTACs促进了新一代PROTACs的开发。

44、第二代PROTACs

利用小分子作为E3泛素连接酶的部分的技术使得基于小分子的PROTACs得到快速发展（图4）。

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图4 基于小分子的PROTAC的示意图

基于小分子的PROTACs与基于肽的PROTACs相比具有许多优势。最重要的是，基于小分子的PROTACs更有希望被开发成药物，因为小分子更容易为人体吸收，比肽更具潜力。Crews研究组将注意力转向新一代小分子PROTAC技术。他们用于聚乙二醇（PEG）的Linker将非甾体AR配体（称为选择性AR调节剂，SARM）与nutlin（MDM2配体）连接起来做成PROTAC分子。MDM2配体nutlin是一种咪唑啉衍生物的化合物，阻断MDM2与p53的相互作用。试验显示，该PROTAC在HeLa细胞和LNCaP细胞中诱导AR的强烈降解。

Crews研究组也使用疏水标签（HyTs）使结合蛋白不稳定（疏水部分暴露）以降解。他们合成了几种含HyT的化合物，测试它们对不同Halo标签融合蛋白的影响。这种HyTs证明了这样一个概念：小分子可能与蛋白质结合并使蛋白质处于不稳定状态，然后被泛素蛋白酶体或自噬降解。与此同时，Crews研究组根据HIF1α肽设计了小分子配体。保留羟脯氨酸部分，因为其是高亲和力结合VHL的关键。他们将抑制ERRα的噻唑烷二酮的配体与羟脯氨酸部分连接起来，合成了降解ERRα的PROTAC。接下来，又将Vandetanib与具有12个原子接头的羟脯氨酸部分连接起来，设计了降解丝氨酸-苏氨酸激酶RIPK2的PROTAC。他们测试了PROTAC对MCF-7乳腺癌细胞与人THP-1单核细胞中ERRα和RIPK2表达的影响，证明该PROTAC分子能够通过泛素-蛋白酶体途径降解ERRα和RIPK2。此外，该羟脯氨酸衍生物进一步用于合成Halo-PROTAC，以靶向降解HaloTag7融合蛋白。

目前，已经有许多基于小分子的PROTACs用于降解BET家族蛋白。BRD4的抑制剂已有长期研究基础，且在针对MYC驱动的恶性肿瘤的治疗中显示出了希望。第一个降解BRD4的PROTAC是将BET抑制剂JQ1与结合VHL的小分子连接起来。该PROTAC命名为MZ1，其可显著诱导BRD4的降解。另一个名为ARV-825的PROTAC，是将OTX015与Pomalidomide通过一个具有柔性的聚乙二醇链连接起来，利用含CRBN的E3泛素连接酶降解BRD4。ARV-825被证明在不同的癌细胞上发挥作用，并极大地诱导癌细胞凋亡。同一时间，Winter等人使用Thalidomide连接JQ1，形成新的PROTAC。这种基于Thalidomide和Pomalidomide的PROTACs设计可能在临床应用中具有很大的优势，因为二者均为一种经批准的药物。试验证明，设计的这两种PROTAC在细胞和动物实验的白血病模型中均可降解BRD4。

基于小分子的PROTACs进一步扩展到降解激酶BCR-ABL。新的PROTACs将伊马替尼、伯舒替尼、达沙替尼与结合VHL的小分子或Pomalidomide连接起来。此外，还有将CDK9抑制剂和沙利度胺连接起来的PROTAC，用以降解CDK9。

为了克服细胞渗透性不足和基于肽的PROTACs的不稳定性，Hashimoto研究组专注于使用cIAP1的E3连接酶降解目标蛋白。他们设计的PROTAC是将甲基苯丁抑制素类似物（MeBS，methylbestatin）与全反式维甲酸连接起来，靶向降解CRABP-I和II。MeBS与CIAP1的杆状病毒IAP重复结构域结合，全反式维甲酸则是CRABP-I和II的抑制剂。试验结果显示，基于cIAP1的PROTAC能够诱导细胞内CRABP-I/II蛋白的泛素化和降解。其它基于cIAP1的PROTACs则是将抑制剂MeBS与多个靶标的小分子抑制剂连接起来，这些靶标包括RAR，ER，AR和TACC3。但是，由于MeBS本身选择性不高，缺乏活性，故利用它设计的PROTACs的活性也不够好，没有候选分子进入动物实验。Naito和Hashimoto将基于MeBS设计的PROTACs命名为SNIPER（Specificand Nongenetic IAPs‐dependent ProteinERaser）。他们不断地设计SNIPER分子来降解各种蛋白。很有意思的是，他们透露其设计的一种基于MeBS的PROTAC没有招募cIAP1而是招募另一种E3连接酶APC/CCDH1。

据统计，目前已有小分子配体的E3连接酶有SCF、MDM2、CIAP1、CRBN、VHL和APC/CCDH1。

5PROTACs可降解的致癌蛋白

好消息是，已有30多个蛋白可以利用PROTACs降解。降解致癌蛋白成为一种治疗癌症的可行新策略（图5）。可降解的靶蛋白包括核受体（ER、AR和RAR），蛋白激酶（Akt、BCR-Abl、c-Abl、BTK、ALK、CDK9、RIPK2、DAPK1和PSD-95），蛋白质转录调控蛋白（BRD4、Sirt2、HDAC6、TRIM24、IKZH1/ 3和Smad3），调节蛋白（CRABP-I/II、TACC3、AHR、FKBP12、ERRα和X-protein），神经退行性相关蛋白（Huntingtin）、Tau，α-突触核蛋白和PSD-95），细胞代谢酶（MetAP-2和DHODH）和融合蛋白（HaloTag）。

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图5 靶蛋白、靶蛋白配体、E3配体和E3的总结

5.1、降解核受体

基于肽和基于小分子的PROTACs都被设计用于靶向降解ER、AR和RAR。ER和AR的PROTACs设计已经在上面详述过。这里，我们讨论一下PROTACs在降解ER和AR方面取得的一些可喜进展。一个进展是使用4-羟基三苯氧胺与MeBS连接的SNIPER（ER）-3，它通过含cIAP1的E3泛素连接酶靶向泛素化标记ERα，并有效诱导ERα降解。从而阻断了雌二醇下游基因PS2的表达，强烈诱导了ROS的产生，并最终导致ER阳性细胞系MCF-7细胞的凋亡。但对其它ER阴性细胞无影响。最近，一种新的PROTAC利用非类固醇选择性ER降解剂（SERD）诱导ER的降解，该PROTAC分子量更小，但降解活性更强。

在针对AR的PROTAC上，Crews研究组使用恩杂鲁胺连接VHL配体，该PROTAC分子命名为ARCC-4。他们的试验表明，ARCC-4在所有前列腺癌细胞系（VCaP，LNCaP和22Rv1）以及乳腺癌细胞（T47D）中均可靶向降解AR。进一步的试验显示，ARCC-4抑制AR诱导的前列腺特异性抗原（PSA）在VCaP细胞中的表达。有趣的是，他们还发现ARCC-4诱导AR突变体（F876L、H874Y、M896V、T877A和L702H）的降解。这让治疗AR突变的前列腺癌有了希望。此外，Raina研究组开发的名为ARV-771的PROTAC，通过连接pan-bet抑制剂，不仅降解了BRD4蛋白，还阻止了AR蛋白表达水平和AR信号传导，显著提高了对去势抵抗前列腺癌（CRPC）细胞模型的疗效。

5.2、降解转录调节因子BET家族蛋白

Crews研究组设计了一种名为ARV-825的PROTAC，用以降解含一个溴结构域和外结构域（BET）家族成员的BRD4蛋白。他们将结合含CRBN的E3抑制剂pomalidominde与BRD4的抑制剂OTX015连接起来。试验表明，ARV-825诱导了细胞中BRD4快速和有效的降解。通过靶向降解BRD4，ARV-825与BRD4抑制剂相比显示出更有效的c-MYC抑制。这种新策略克服了BRD4抑制导致大量BRD4蛋白积累的问题。2016年晚些时候，该小组的试验还证实ARV-825对5种MM细胞系（SKO-007，U266，RPMI-8226，ARP-1，JJN3）和产生CD138+的骨髓瘤患者的MM细胞中均有显著抑制作用。前期结果显示，ARV-825优于BET溴结构域抑制剂（JQ1和I-BET151）。接下来，研究者又观察到ARV-825可以诱导CD34+post‐MPNsAML细胞更显著地凋亡。试验显示，ARV-825导致BRD4下游基因表达水平持续减少和某些基因增加。减少的包括c-Myc、CDK4/6、JAK2、pSTAT3/5、PIM1和Bcl-xL，增加的是p21和p27的表达水平。这些结果也证明，降解BRD4的PROTACs比BRD4抑制剂更优。

另外，Zengerle研究组设计的PROTAC是将JQ1与结合VHL的配体连接起来。他们观察到这种PROTAC在含BET蛋白的细胞内特异性降解BRD4。有趣的是，和前面的ARV-825一样，该PROTAC不仅导致BET家族蛋白质的快速、有效和长期降解，也导致BRD4下游Myc、p21和AREG的变化。由于BET蛋白质对NF-kB激活的基因表达至关重要，有研究者认为，降解BET蛋白的PROTACs抑制了脂多糖（LPS）激发后小胶质细胞的促炎反应。

Raina研究组设计的ARV-771，与BET抑制相比，除了显着提高了CRPC细胞模型的疗效。在另一项研究中，发现其提高了HEL92.1.7细胞移植NSG小鼠的生存期，对于小鼠白血病的治疗效果优于OTX015。最近，有研究报道了基于BET抑制剂的PROTAC、ARV-825和ARV-771对MCL细胞的作用。结果显示，BET-PROTACs诱导MCL细胞凋亡的效果比BET抑制剂更好。BET-PROTAC可诱导依鲁替尼抗性细胞的凋亡。对于c‐Myc、CDK4、cyclinD1、Bcl‐xL,XIAP和BTK，用BET-PROTAC处理比BET制剂更显著地降低了对应蛋白的mRNA和蛋白水平。试验还观察到BET-PROTAC还诱导了HEXIM1，NOXA和CDKN1A/p21的表达增加。另外，试验显示ARV-771较ARV-825药理学特性更优异。与OTX015相比，ARV-771治疗的MCL细胞移植裸鼠抑制体内肿瘤生长显著被抑制，且提高了裸鼠的的生存期。然后，研究者证明ARV-771可与Ibrutinib、Venetoclax和Palbociclib协同作用，诱导MCL细胞凋亡。

2018年，使用PROTAC靶向降解BET家族蛋白质成为热点。Qin等人利用Oxazepines设计了一种名为QCA570的PROTAC用以降解BET蛋白。其在低皮摩尔浓度下有效诱导BET蛋白降解，并抑制人急性白血病细胞增殖。试验证明QCA570可以完全消除小鼠白血病异种移植模型中的肿瘤。最近，张和他的同事们针对BRD4和其他BET家族成员设计了PROTACs，其可有效抑制骨髓瘤细胞，且效果呈时间依赖性和浓度依赖性。PROTAC处理后的骨髓瘤细胞显示G0/G1停滞，CDK4/6表达降低，p21表达增加，诱导细胞凋亡。该小组报告他们的PROTAC特异性地降低了BRD4下游基因，包括c-MYC和N-MYC。值得注意的是，试验表明PROTAC克服了硼替佐米，地塞米松，来那度胺和泊马度胺的耐药性。该PROTACs还能够诱导从骨髓瘤患者来源的原代癌细胞的活力损失，抑制基于MM1.S-异种移植物的肿瘤在小鼠内体的生长。通过修饰脯氨酸的羟基化可以提高PROTAC降解BRD4的100倍活性。然而，最近报道了BET降解剂的脱靶现象，研究发现其可以降解TRIM24（该蛋白也包含一个溴结构域）。

5.3、降解蛋白激酶

PROTACs还可以降解除BET家族蛋白之外的其它蛋白。2016年，设计了降解Akt的PROTAC。他们将PCC试剂连接上细胞穿透肽，使得PROTAC可以进入细胞内部。再用PEG的Linker连接HIF-1α的7肽ALAPYIP。该PROTAC被证明可促进癌细胞中Akt的快速降解。

接下来，Lai等人设计了一种PROTAC，利用含CRBN或VHL的E3来降解c-ABL和BCR-ABL。该PROTAC的目标蛋白连接端使用的是抑制剂imatinib，bosutinib和dasatinib。2017年，Robb等人设计的PROTAC利用含CRBN的E3成功诱导了CDK9的降解。研究者发现该PROTAC在HCT116细胞中选择性地降解CDK9而不影响其他CDK家族成员。还有课题组使用天然产物汉黄芩素设计了PROTAC成功降解了CDK9。汉黄芩素是CDK9抑制剂Flavopiridol的类似物。

2018年，Zhang等人使用ALK抑制剂设计了降解ALK的PROTACs。这些PROTAC分别命名为MS4077和MS4078。试验表明，这两种PROTACs显著降低了SU-DHL-1（淋巴瘤）和NCI-H2228（肺癌）细胞系中ALK融合蛋白的水平。Kang等人设计了另一种降解ALK的PROTAC。试验证明，利用VHL构建的PROTAC在小鼠体内可以降解ALK蛋白。另外，有研究者发现其设计的降解ALK的PROTAC还促进了其它激酶如PTK2、AuroraA、FER和RPS6KA1的降解。

目前，PROTACs可以降解的激酶蛋白有RAR、PI3K、CRABPI/II、ALK4、Smad3、CDK9、HDAC6、Sirt2、BTK、CK2和TBK1等。大多数激酶是细胞定位或核定位的。但，对于PROTAC是否真的降解了EGFR，还需进一步论证。为了检验这种可能性，Crews研究组将EGFR抑制剂Iapatinib与VHL配体连接起来设计了一种PROTAC，用于降解EGFR、HER2和c-Met。有趣的是，该PROTAC诱导了EGFR的内化，但却是通过溶酶体降解的。

6展望

虽然PROTACs用于药物开发前景广阔，但存在的问题阻碍了其临床应用。这些问题包括脱靶、低细胞渗透性、不稳定性、不易合成和超大的分子量。好消息是，许多研究机构开始以不同的方式克服这些问题。如缩短PROTAC的新战略：点击形成PROTAC（TCLIPTAC）。这是将大的PROTAC分子分离成两个部分，一部分是四嗪标记配体结合目标蛋白，另一部分是反式-环辛烯标记配体识别E3。它们能够在细胞中“点击”以形成PROTAC。点击反应使得在体外的PROTAC前体合成更简单，渗透性更好，分子更稳定。总之，PROTAC技术正在快速发展，必将成为药物开发的主流方法。

参考文献

doi: 10.1002/cbf.3369

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PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列

1、蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】

2、【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2

3、【PROTAC】新药开发系列（三）降解雌、雄激素受体