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[开发实例] ​【PROTAC】新药开发系列(十三)揭秘丙肝神药作用机制I

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发表于 2019-4-8 17:33:36 | 显示全部楼层 |阅读模式

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不得不说,PROTAC技术把蛋白降解机制的研究带入了一个广阔天地。本期揭秘丙肝神药作用机制I和大家分享来自AbbVie公司2018年底的文章,也正如之前我在蛋白降解新药开发小讲堂所预测的一样,该文验证了蛋白降解机制与免疫系统的直接关系。这将开启小分子化药调控免疫机制的新领域。试想一下,当小分子药物降解了具有突变基因的蛋白,或者是外源性蛋白,如HIV、HBV等病毒蛋白,形成了这些与内源性MCH-I肽库中有明显区别的肽片段,并呈递到细胞表面。这将导致什么样的结果呢?是的,这些MCH-I肽将直接启动毒性T细胞,使得癌变细胞或被感染的细胞被全部清除。Glead和AbbVie的丙肝药已经做到。对于药物化学家来说,这绝对是一个划时代的机遇。别再观望,加入降解致病蛋白的小分子新药开发队列来吧,这将是我们中国创新药物开发弯道超车的天赐良机。
下周,我们将继续推出揭秘丙肝神药作用机制Ⅱ,欢迎关注!

摘 要

被I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递的肽是免疫疗法的重要靶标。这类肽靶标的鉴定极大地促进了T细胞治疗剂的产生。在本文中,我们报道了靶向嵌合体(PROTAC)分子通过降解目标蛋白产生内源细胞蛋白的特定MHC-I肽的呈递。我们使用LC-MS/MS鉴定了用三种降解BET蛋白的PROTAC处理产生的几种BET特有的MHC-I肽。接下来,我们使用无标记质谱定量测量了这些肽在不同处理条件下的相对呈递速率。我们发现肽呈递速率反映了蛋白质降解速率,这表明了PROTAC治疗和肽呈递之间的直接关系。另外,我们还分析了PROTAC治疗对整个免疫肽组的影响,发现了许多以PROTAC特异性方式展示的新肽:我们确定这些鉴定结果与BET途径相关,或存在潜在的脱靶及独特的PROTAC降解途径。这项研究工作首次证明了使用PROTAC分子降解目标蛋白可产生内源性细胞蛋白的特定MHC-I肽的呈递,突显了利用PROTAC分子发现和产生免疫治疗新靶点的潜力。

                               
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背 景

由主要组织相容性复合物(MHC)呈递给免疫系统的肽可作为反映母细胞健康的生物标志物。MHC-I肽复合体通过T细胞受体(TCR)被CD8+ T细胞识别,对功能正常的细胞的适应性免疫反应至关重要。这些肽与特定的MHC蛋白结合,形成独特的三维表位表面,作为细胞疾病的抗原,这些疾病包括感染和癌症。MHC-I肽作为免疫治疗的新靶点已备受关注,包括嵌合抗原受体转导的T细胞(CAR-T)、可溶性T细胞受体(sTCR)和肽疫苗。
MHC-I肽源于内源性蛋白(所谓的退休蛋白)的降解,以及有缺陷的核糖体产物。虽然也有一些例外,但大多数情况MHC-I肽来源于泛素-蛋白酶体途径依赖的降解方式。一旦目标蛋白被降解,这些肽将通过转运蛋白到达内质网(ER)进行抗原加工(TAP),由N-末端氨肽酶ERAP1和ERAP2进行修剪,并装载到MHC-I蛋白上,转运到细胞表面,并由细胞毒性CD8+ T细胞识别和监测。
由于MHC-I呈递的大多数肽被认为源于蛋白降解,我们假设可以通过有目的的蛋白降解来刺激特定MHC-I肽的呈递。化学生物学的最新发展提供了一种称为蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)的工具,用以验证我们的假设。PROTAC分子通过将E3泛素连接酶募集到目标蛋白上来靶向泛素化标记该蛋白,诱导目标蛋白降解,如图1所示。

                               
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图1 PROTAC分子诱导MHC-I肽的呈递
蛋白降解PROTAC技术最初是作为蛋白抑制剂的替代品开发的:PROTAC分子不与蛋白结合并抑制其活性,而是在细胞内催化目标蛋白的泛素化标记,诱导致病蛋白的降解。我们假设PROTAC分子诱导目标蛋白降解后的肽产物可用于MHC-I抗原加工和呈递。如果是这样,那么我们将能够观察到使用PROTAC分子时细胞表面上MHC-I肽库的变化。具体而言,我们期望观察到源自目标蛋白的MHC-I肽。

PROTAC分子降解目标蛋白可在细胞表面上产生新的MHC-I肽。首先,使用一种PROTAC分子可以在一个选定的系统内降解目标蛋白,并进行肽的检测。目前,该领域依赖于预测算法来鉴定可能从目标蛋白产生的MHC-I肽。使用PROTAC分子将减少对预测的依赖性,因为这些预测有时会提供接近但不精确的肽序列。另外,降解产生的MHC-I肽可以增强某些肽的存在,使得用现有的分析方法更容易检测到它们。

使用PROTAC分子作为MHC肽呈递的催化剂的第二个优点是能够诱导或增强特定的肽,这些肽可以被基于T细胞的治疗剂靶向。通过复合物的一般上调来增强MHC-I信号的能力已经被证明可以增强T细胞应答。在内源系统中增强特定T细胞靶标的能力可为基于T细胞的治疗剂的产生和应用提供巨大优势。

最后,在MHC-I呈递的背景下使用PROTAC分子,通过监测内源系统中目标蛋白的降解,使我们能够探索MHC-I呈递途径的离散组分,从而增强对生物学的理解。使用质谱技术更全面地分析PROTAC处理后肽库的变化,不仅可以探索MHC-I呈递途径的成分,还可以研究受定目标蛋白降解干扰的潜在生物途径。

最近,一种卵清蛋白肽SIINFEKL(S8L)的dTAG-融合蛋白被报道可经泛素-蛋白酶体途径降解。流式细胞术显示S8L肽在被转染的源蛋白降解后由MHC-1呈递。虽然这项研究确定了目标蛋白的细胞内浓度与其肽呈递水平之间的关系,但利用PROTAC分子调节内源性蛋白质的降解在以前还没有探讨过。此外,尚未有用PROTAC处理对细胞免疫肽组分的影响进行分析。

这里,我们演示了PROTAC分子的应用,它成功降解了目标蛋白,并诱导在细胞表面上呈递特异性的MHC-I肽。我们选择了具有良好性质的PROTAC分子(结合溴端域和末端结构域并诱导BET蛋白的降解)来评估目标蛋白降解对MHC-I肽呈递的影响。这些PROTAC分子一端使用溴结构域抑制剂JQ1,一端则是结合E3连接酶的配体。本研究使用三种PROTAC分子:JQ1-CRBN(ARV-825)利用泊马度胺募集E3连接酶CRBN,JQ1-VHL(ARV-771)募集VHL连接酶,最后,JQ1-MDM2募集MDM2。由于目标蛋白与E3连接酶的相互作用,它们一些配对被认为是最优的选择,我们非常感兴趣地研究了不同PROTAC在MHC的呈递种产生MCH-I肽的能力。此外,BET蛋白由于可识别和结合乙酰化赖氨酸残基的能力而成为重要的疾病靶点。在此过程中,这种蛋白家族具有调节转录活性。随后,BET蛋白被证实是多种癌症的关键靶标,因此,特异性降解BET蛋白的PROTAC分子作为治疗癌症的一种手段得到了广泛的应用。

此外,我们还选择使用基于JQ1的PROTAC分子来检查MHC-I肽的呈递情况,因为它们已被广泛研究,并提供了一个预定义的系统用于评估可能受治疗影响的复杂肽混合物的潜在变化。特别是,用JQ1-VHL进行的结构研究表明,BRD蛋白和E3连接酶之间的协同结合能够选择性降解BRD蛋白。另外,降解是通过E泛素连接酶与BRD蛋白结构内特定溴结构域而产生的。例如,JQ1-VHL优先结合到BRD4的BD2,然后是BD3的BD2,再是BD2的BD1来启动降解。对于JQ1-MDM2和JQ1-CRBN,这些溴域与E3连接酶的协同作用尚未被测定。

我们利用LC-MS/MS鉴定了来自PROTAC分子处理和对照处理细胞中分离出的MHC-I肽,并发现由PROTAC分子处理产生的特异性MHC-I肽。我们观察了这些肽在几个时间点的相对丰度,以了解蛋白降解和表达之间的关系。我们还检查了整个观察到的免疫肽组的变化,以了解由PROTAC处理引起的MHC-I肽的全局变化。综上所述,我们证明了一种新的方法可诱导细胞表面上特异性MHC-I肽表位的呈递,有效地扩大了靶向肽的范围,且这些靶向肽是以可以控制的方式呈递的。

结 果


1PROTAC分子可降解目标蛋白
我们合成了JQ1-CRBN、JQ1-VHL和JQ1-MDM2,并通过Westernblot评估了其降解BV73细胞中BET蛋白的能力。在不同浓度下,我们观察到这些PROTAC分子对BRD蛋白质的降解。同时,我们还评估了时间依赖性降解,以比较统一浓度范围内每种PROTAC分子降解BET蛋白的相对速率。试验显示,蛋白质降解的效率与以往报道一致。其中,JQ1-CRBN和JQ1-VHL表现相似,成功降解BRD2、BRD3和BRD4,而JQ1-MDM2在BET蛋白降解方面效果较差。

2PROTAC处理不会改变细胞表面MHC-I的量
为了理解肽变化对总免疫肽库的贡献,我们使用流式细胞术分析了PROTAC处理(在10和100nM,从0到6小时)对细胞表面上MHC-I量的影响。我们使用pan-HLA抗体W6/32以及HLA-A*02抗体BB7.2对MHC-I的存在进行染色,发现细胞表面上总的MHC-I没有增加(图2A),这表明观察到的特定肽的任何变化不是由于MHC-I自身上调所致。

                               
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图2 PROTAC处理对BV173细胞的影响
3、经和未经Protac处理的肽片段具有相似的HLA结合特异性
我们使用BB7.2(抗-HLA-A2)和W6/32(抗-pan-MHC-I)抗体通过免疫沉淀从BV173细胞中分离的MHC-1肽复合物。利用LC-MS/MS检测从MHC-I复合物中洗脱的肽,并使用Byonic软件查询所得光谱。通过搜索人蛋白质数据库(Uniprot)来鉴定肽,并将结果过滤至1%的错误发现率(FDR)。为了进一步标准化数据,消除了由>5ppm前体离子质量精度和/或单肽谱匹配(PSM)引起的肽鉴定。应用这些标准后,我们在所有实验中保留了源自3,200种蛋白来源的约7,500种独特肽序列。已鉴定肽的完整列表可在补充文件中找到。该优先列表包括大小不等的肽,大多数(92%)长度在8至14个氨基酸之间。我们发现PROTAC处理(或对照化合物处理)对数据集中肽的长度分布没有影响(图2B)。此外,在所有样品中,大约60%的已鉴定肽是9聚体,这与之前有关MHC-I分离的报道一致。

为了帮助确定这些肽片段具有与HLA结合相关的特征,分析了我们分离的免疫肽的基序,并发现:(1)这些基序在处理和未处理的样品之间是一致的,(2)鉴定的基序适用于表达HLA等位基因的BV173细胞系(HLA-A* 02:01,HLA-A* 30:01,HLA-B* 18:01,HLA-B* 15:10,HLA-C* 12:03,和HLA-C* 03:04)(图2C)。

我们利用免疫表位数据库(http://www.iedb.org/)结合稳定矩阵法(SMM)和人工神经网络(ANN)算法,预测了分离出的8到14个氨基酸之间的免疫肽的亲和力。从完整数据集中,我们观察到对HLA-A*02:01具有更高亲和力的肽的表达增加。然而,我们仍然能够从IEDB资源中可获得的等位基因中鉴定出对我们细胞系内所有代表的MHC-I等位基因具有高预测亲和力的肽。使用SMM和ANN算法比较了PROTAC处理的样品与DMSO处理的亲和力曲线,我们发现PROTAC处理的高亲和力(IC50在0-100nM)肽的分布没有变化。然而,我们确实观察到PROTAC处理的中等亲和力(IC50在1-10μM)HLA-A* 02肽的量略有增加,在相同亲和力范围内,HLA-B*18的表达也相应减少。在使用SMM和ANN亲和力算法进行分析时,我们观察到这种效应(图2):在所有其它代表性等位基因中,预测肽亲和力的分布没有变化。总之,经PROTAC处理的样品与未处理的保持相同的呈递特征,在中等浓度下,肽亲和力略有变化。

4、经处理和未处理的样品的标识的本体分布一致
使用Panther和Proteomaps全局评估BV173中MHC-I肽组的组成。Panther分类系统用于基因本体(GO)术语的分配。我们使用该工具从每种处理中分离出MHC-I肽与人类蛋白质组进行比较,以寻找特定细胞组分和生物过程的过度表现。与以往HLA肽分离的报道一致,我们观察到主要来源于细胞组分的肽的过度呈递,如蛋白-DNA复合物(p-value= 7.54 E-05),核(p-value= 7.98 E-47)和核糖体(p-value= 4.14 E-10),膜结合蛋白的表达不足(p-value= 4.29E-06)。在所有处理的样品(除DMSO之外的所有样品)中,我们观察到糖酵解过程过度增加(p-value= 1.58E-04)。除此之外,我们没有发现PROTAC处理的样品和对照样品之间基因本体论的任何显著变化。我们还使用Proteomaps软件来可视化分析数据集中的本体分布。以每种来源蛋白的独特肽的数量作为显著性的测量,我们的Proteomaps表达与以往报道相似,并且未发现PROTAC处理的样品和对照样品之间存在差异。

5PROTAC处理的样品中发现了独特BET(和其源蛋白
为了研究PROTAC对源蛋白鉴定的依赖性变化,我们采用了两种方法。首先,我们观察了哪些来源的蛋白仅在PROTAC处理时可见,而非对照处理。在用三种基于JQ1的PROTAC分子处理后,共观察到95种来源蛋白。我们试图用每种蛋白质的PSM数量作为流行程度来对这些处理后的特异性源蛋白鉴定进行排序。然后,我们能够将PROTAC处理诱导的特异性蛋白从最可能到最不可能进行排序。值得注意的是,BRD3被列为具有最多观察到的PSM,其次是TAF8(一种转录相关蛋白)。图3B中列出了前10个最典型的蛋白(通过PSM计数,总共166个重复,122个PROTAC处理的重复)。

                               
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图3 在所有时间点和浓度下来鉴定免疫肽来源蛋白
6PROTAC处理增强了BET蛋白它蛋白的来源蛋白覆盖率
第二种方法涉及鉴定来源蛋白,在对照组(处理前)观察到一些肽,但经PROTAC处理,通过增加肽覆盖率来增强其呈递。我们比较了处理和未处理样品之间每种蛋白的肽总数的变化,假设已在对照处理的样品中表达的蛋白,在PROTAC处理刺激时可能会呈递额外的肽(图3C)。对于该分析,我们使用比率:计算每个处理中每种来源蛋白的肽/蛋白的数量,并比较每个处理之间的蛋白质值:蛋白质特异性倍数变化=[肽/蛋白质] PROTAC /[肽/蛋白质] 对照。通过该分析,我们能够确定在PROTAC处理的样品中与对照组相比具有增加的表达的特定蛋白质(图3D)。值得注意的是,BRD2、Nck相关蛋白1样(NCKPL)和少数其它蛋白在PROTAC处理后表现出增加。

7、在经PROTAC处理的样品中观察到了独特BET肽序列
PROTAC分子诱导了BET衍生的MHC-I肽的呈递,在肽MS/MS光谱(图S6)和>2PSM 验证的PROTAC特异性序列(图4A)中可看到。这些肽在由JQ1、pomalidomide或DMSO处理的细胞制备的样品中未观察到。为了验证这些肽对PROTAC处理的独特性,我们提取前体质量(+/-10ppm)的离子色谱图,并在样品之间进行比较。BRD3特异性肽的示例如图S7所示。在检测范围内,我们没有发现这些肽在对照样品中出现的证据。

                               
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图4 经PROTAC处理产生的BRD肽
当查看经PROTAC处理产生的BET肽列表时(图4A),我们观察到所有三种PROTAC分子均诱导相同的两种MHC-I肽:KMDPEVEA(BRD3)和RLAELQEQL(BRD2/3/4)。无论E3连接酶募集因子是谁,我们都观察到了这两种肽。此外,JQ1-CRBN和JQ1-VHL均诱导BRD2呈递HQVPAVSSV和LHSAGPPLL。我们未观察到来自JQ1-MDM2处理的BRD2肽。我们还注意到,对于每种BRD蛋白,PROTAC诱导产生的肽来自BRD蛋白的第一(BRD2)或第二(BRD3,BRD2/ 3/4)溴结构域附近(图4B)。

我们使用SMM和ANN算法预测了四种已鉴定的BRD肽与MHC-I结合的亲和力,发现它们合适的等位基因具有一系列预测的IC50值。然而,没有新检测到的肽能有超过100nM(IC50)的亲和力(图5)。当使用IEDB亲和力资源扫描每种BRD蛋白的完整序列以预测HLA结合9聚体时,我们注意到有几种候选肽被预测为可用MHC-I等位基因的更强结合物。但,细胞未选择这些肽序列用于呈递。另外,在对照组和处理过的样品中,内源性呈递的BRD2肽TAAPPAQPL具有比用PROTAC处理的任何肽具有更高的预测亲和力。

                               
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图5 经PROTAC处理产生的BRD肽对BV173等位基因具有次优亲和力
8BET来源的免疫肽的丰度取决于PROTAC浓度和处理时间
为了比较不同条件下分离的免疫肽的相对丰度,我们采用无标记质谱定量法。为使所有样品中的信号标准化,我们选择了一组29个内源肽应用了校正因子,因为它们具有一致的呈递和丰度范围。我们用10nM的PROTAC分子处理6小时(图6),然后测量了两种最常见的BET肽(KMDPEVEA和RLAELQEQL)的相对丰度。PROTAC诱导的BRD2肽在我们的数据集中并不足以用来绘制丰度曲线。它们的偶发性与BRD2蛋白的非强烈降解一致。在比较6小时内PROTAC诱导肽的相对丰度时,我们发现JQ1-VHL和JQ1-CRBN在产生BET衍生肽方面比JQ1-MDM2更有效。前两种蛋白复合物在较短时间内呈递出了相应的肽,并达到最大丰度。我们将目标蛋白降解(用Westernblot测量)与每个肽丰度图叠合,以比较降解率与肽的呈递速率。我们观察到降解的肽丰度以一种PROTAC特异性方式反映了目标蛋白的降解。

                               
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图6 用10nM 的PROTAC分子处理后BRD肽的呈递速率
我们比较了BRD3肽KMDPEVEA在高(100nM)和低(10nM)浓度的JQ1-VHL和JQ1-CRBN之间的呈递速率(图7)。我们还将此表现与其相应的目标蛋白降解进行了比较。我们观察到了几种趋势。首先,较高浓度的PROTAC在3小时的时间范围内引起了更高的响应。其次,目标蛋白在较高浓度下的快速消耗导致所呈递的肽较迟的消耗,并且,这些肽的总体呈递速率反映了由每种PROTAC诱导的目标蛋白降解速率。

                               
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图7 使用不同的PROTAC浓度比较BRD3的蛋白质降解和肽呈递速率
9在检测到的HLA配体观察到PROTAC诱导的通路变化
为了深入了解潜在的意外PROTAC诱导的变化,我们对PROTAC处理的数据集中特征蛋白以及PROTAC处理后覆盖率增加的蛋白进行了Ingenuity Pathway Analysis(IPA)绘图。在进行仅具有高置信度或实验观察到的关联的核心定位分析后,我们发现经PROTAC处理(p-value = 5.07 E-03)mTOR通路及其密切相关通路的信号转导均被上调。另外,我们观察到Myc(p-value = 1.29 E-02)、CDK4/ 6(p-value = 6.32 E-04)、E2F1(p-value = 7.82 E-04)和E2F4(p-value = 1.16 E-03)是PROTAC特异性和增强的上游转录调节子。

四 讨 论

总的来说,该研究的结果使我们能够在用三种BET导向的PROTAC分子处理后鉴定MHC-I免疫肽的局部和全局变化。我们发现BET-PROTAC处理可产生BRD蛋白特异性MHC-I肽的呈递,以及来自其它蛋白的肽,这些肽可以映射到与BET抑制和降解相关的已知通路。尽管有这些变化,我们发现PROTAC处理对细胞表面MHC-I的总量没有明显影响。此外,我们发现在任何处理条件(如PROTAC、JQ1、pomalidomide或DMSO)下观察到的肽样品的长度、基序或本体分布没有重大变化。没有观察到广泛的细胞扰动,这与我们对抑制剂JQ1的预期一致。然而,在较高的IC50值下,我们确实观察到到等位基因特异性肽亲和力的微小变化,这表明PROTAC处理可能改变用于MHC-I加工和呈递的可用肽库。其他人也注意到,可用的HLA蛋白量是肽呈递的限制成分。在不刺激细胞以增加MHC-I的丰度的情况下,通过诱导的蛋白降解产生的肽将竞争性占据MHC-I。

虽然其他实验室已经强调了滴度对HLA型ligandome的作用和贡献,但通过该机制获得的免疫活性肽的百分比比降解的低。我们对PROTAC诱导产生的肽的来源的评估主要基于动力学观察。例如,我们发现BET肽呈递速率与BET蛋白降解速率相匹配。而且,更高浓度的PROTAC将更快速耗尽内源性目标蛋白,导致了检测到源自这些蛋白的肽丢失。尽管经PROTAC处理产生的一些呈递肽可能仍然源自DRiP,但我们的结果表明降解BET蛋白获得MHC-I肽的呈递的变化大部分是通过蛋白泛素化和降解产生的。

总的来说,我们检测到四种BRD衍生肽,它们符合我们在用BET-PROTAC分子处理后鉴定的严格标准。这些肽源于BRD2、BRD3和BRD4蛋白之间共有的保守区。由于多种原因,一些BRD2/3/4肽RLAELQEQL可能来源于内源性BRD4。首先,10nM的所有PROTAC分子仅有限地降解BRD2,导致在我们的试验过程中偶尔发现BRD2的肽。此外,BRD2仅在6小时内被JQ1-MDM2有限地降解,但JQ1-MDM2处理产生了肽RLAELQEQL的呈递。我们还观察到BRD2/3/4肽的呈递反映了BRD4的相应降解(图6B)。最后,RLAELQEQL呈递的动力学不同于BRD3衍生肽KMPDEPVEA(尽管来源区域相似,并且SMM预测相同等位基因的亲和力一致,HLA-A* 02:01)。然而,仅预测的亲和力不足以预测通过MHC-I途径的有效加工,仅这些观察不足以确定RLAELQEQL的来源蛋白。

我们观察到所有BET衍生肽源自每种BRD蛋白的不同区域。这一观察结果可能是由于我们细胞系内特定的蛋白酶体组成和MHC-I加工机制所致,因为其他人已发现每种蛋白质中抗原呈递的特异“热点”。有趣的是,这些肽来源位置与报道的每种蛋白质中JQ1-VHL的协同结合偏好很好地对应。例如,JQ1-VHL优先结合并降解BRD4的BD2 >BRD3的BD2 >BRD2的BD1,这与每个肽来源的特定BD结构域很好地对应,表明配体与靶蛋白特定区域的结合可能影响哪些肽最容易呈现(图4)。此外,尽管它们不具有最佳结合亲和力(图5),但它们并不一定是使用IEDB预测工具分析的MHC-I加工和呈递的最佳候选肽。由于保守肽(RLAELQEQL)是来自BRD4的适当区域的最佳肽,因此缺少BRD4的独特肽。

如果PROTAC分子能够从目标蛋白的特定区域直接产生MHC-I肽,那么该过程可以通过PROTAC驱动的泛素化过程的选择性来调节。PROTAC分子已被证明导致特异性蛋白赖氨酸残基的泛素化,明显不同于内源泛素化蛋白位点。人们普遍认为,蛋白酶体加工产物通过产生MHC-I肽前体来驱动MHC-I肽库。泛素化中的位点特异性或特异性蛋白的变化可能导致蛋白酶体加工的改变,影响MHC-I前体肽的序列和可用性。这一假设得到了来自目标BET蛋白的MHC-I肽的次优亲和力的支持。了解特定泛素化位点与MHC-I肽呈递之间的关系是一个有趣的未来研究方向。
除了BET衍生肽的MHC-I肽外,我们还观察到PROTAC处理产生的许多其它肽。使用IPA绘制PROTAC独特和PROTAC增强的鉴定,我们观察到BET抑制的直接和补偿效应。具体而言,我们观察到Myc被鉴定为PROTAC诱导的上游调节因子。Myc通路的破坏被认为是癌症中BET的作用机制。在BET蛋白降解后(与抑制相反),其他人注意到CDK4/6及其相关通路也受到影响。这一观察表面,BET抑制和BET降解可能诱导细胞调节的正交模式,已超出单独的Myc通路。我们对CDK4/6,E2F1和E2F4作为PROTAC诱导的肽呈递的潜在上游调节因子,表明这些通路水平的变化可以在免疫肽组内观察到。

考虑到这些信息,我们假设经PROTAC处理诱导或增强的肽来源于三大类蛋白:(1)与PROTAC分子靶向或脱靶相互作用而降解的蛋白; (2)由PROTAC靶向通路直接或间接调节的蛋白; (3)一般细胞死亡或应激信号(例如,在所有处理的样品中观察到的糖酵解信号增加)。在本研究中观察到的最具代表性的PROTAC特异性肽中,有更多的机会通过MHC-I呈递获得对BET型号转导(通过抑制与降解)的未来生物学效果的洞察,以及一般PROTAC诱导的细胞变化,这些变化可以反映E3连接酶的类型和自然功能的破坏。

我们假设使用PROTAC分子诱导免疫治疗的新靶点将依赖于几个复合因素:(1)PROTAC与目标蛋白之间的配对应有效地泛素化目标白并导致其降解;(2)PROTAC诱导的降解应该优化为缓慢降解每个目标蛋白,可以更长时间地供应源肽给MHC-I加工,从而延长MHC-I肽的呈递时间;(3)目标蛋白应该可被MHC-I处理和呈递:蛋白是细胞的组分或涉及生物通路,我们和其他人已经凭经验观察到MHC-I呈递的首选。我们还期望使用基于T细胞的疗法可以降低靶向免疫原性的依赖性(即,即使诱导的肽不具有免疫原性,它们仍然可以被靶向)。此外,虽然我们依靠PROTAC分子通过降解蛋白来诱导MHC-I肽的呈递,但任何类型的不稳定蛋白(或下游效应子)的处理都可能足以诱导MHC-I肽选择性呈递。

综上所述,PROTAC分子最初是作为一种给“不可成药”蛋白量身打造的技术方法。在这里,我们证明PROTAC分子可诱导产生目标蛋白的MHC-I肽的新功能。此外,我们还发现,来自非目标蛋白的肽也可以被诱导呈递到细胞表面,这为揭示新蛋白结合和增加对疾病的生物学理解提供了机会。通过使用PROTAC分子来改变现有免疫肽的平衡并诱导新的MHC-I肽在细胞表面的呈递。这种策略可以进一步扩大“可药蛋白”的范围,并通过提供经验性可检测的目标选择来设计基于T细胞的疗法。

参考文献
doi: 10.3389/fimmu.2018.02697

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