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【阿里杂谈-1】关于计算模拟如何引入酶催化领域的一点思考

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 楼主| 发表于 2012-12-26 20:07:00 | 显示全部楼层
如何在非水相体系中进行酶催化的模拟呢?

这个很多人做过的~关键问题是在于获取有机溶剂或者离子液体的力场参数,现在做的多的还是分子动力学模拟~哈哈
发表于 2012-12-28 10:08:50 | 显示全部楼层
阿里哥,自己实验室没人搞量化计算啊,一直想搞出个用gaussian计算反应路径的例子,但是真难啊。
 楼主| 发表于 2013-1-4 16:51:36 | 显示全部楼层
阿里哥,自己实验室没人搞量化计算啊,一直想搞出个用gaussian计算反应路径的例子,但是真难啊。 ...

我们实验室也没有~所以俺现在还没时间去研究量化呢~哈哈~用gaussian做反应途径的倒是很多,一般来说,就看你的过渡态好不好找了~有时间俺们一起学习吧~哈哈~对了~俺的rosetta做出点门道了~有时间我们讨论一下~哈哈
发表于 2013-1-4 18:09:17 | 显示全部楼层
其次,针对我们酶学工作者,这些模拟手段都能用于什么实际问题的解决呢?1.  我想知道我的蛋白结构和别人的有多相似,活性位点的差异,有木有这个家族共同的结构特征?请用同源模建酶的家族最保守的特征应该是催化中心吧。是否具有这个家族特征最好用blast与同家族的蛋白在序列上做一下比较吧。同源建模是利用了别人的结构做的参照,相似部分照抄(那对于比较是没有意义的)、不同的部分是loop区,还要做renfine。因此,同源出来的可能比较粗糙。然后需要做结构叠合等,也只是给一个参考,不能依赖。总之,比较难。2.  我的酶对底物A作用好,对B不好,为什么?请用同源模建+分子对接+分子动力学(如果条件允许)酶对底物的催化效率问题其实是非常复杂的问题。对A好而对B不好有可能是很多因素造成的。如果是AB间结构差异(这个是最简单)那分子对接也许能找到一些规律,但是如果是AB本身差异呢?比如需要反应的化学键周围差异原子对化学键的影响?这个可能要从量化角度考虑。所以,这个问题要因对象而异,要全面思考。总之,比较难。3.  我的酶催化反应的机理是怎么样的呢?请用量化计算酶催化反应的量化计算至今仍然是难题。其中需要解决的问题太多。首先,全体系量化无法做。做QM/MM如何切割QM部分?交叉部分能量如何计算?切割开以后的键如何饱和等等。其次,如何确定反应路径?如何知道你计算的反应路径是最速反应路径?如果你计算了半天,你找到的路径是低概率路径,那不是白干?所以,这个问题几乎不可能直接要计算来解决。要结合很多实验。总之,特别难。4.  我的酶突变了一些残基后,底物活性/选择性变化了~怎么解释?同源模建+分子对接+分子动力学一个或两个点的突变,在结构上有可能会造成蛋白质整体结构的很大改变,甚至导致无法正确折叠,不能形成可溶蛋白(这也是设计了突变看似合理但是往往没有活力的原因)。而同源出来以后,往往rmsd值差异接近0。如何保证获得真实结构?残基的突变与底物活性、选择性质的改变,有可能是影响的结构、结合口袋的构象,影响了空间或者电性,也有可能是影响了底物进入的通道,也有可能是影响了催化中心的电极性,影响催化中心关键原子的亲电或亲核进攻。如何分析?似乎还得因题而议。总之,这个很难。5.  我想重新设计一下我的酶的底物结合位点,使其作用于底物A,B的活性发生反转?同源模建+分子对接+分子动力学+Rosetta此题同上。另外,同源建模与Rosetta应该是一回事吧。都是用来构建模拟的吧,只是原理不同而已。总之,这个也很难。6.  我的酶做了突变想热稳定性和酸碱耐受性变化了,如何模拟?同源模建+分子动力学(不同温度/pH)温度和pH对于酶性能的影响,至今众说纷纭,没有权威论断。我个人认为其实是两个问题的平衡。一个对于化学反应来说,温度和pH一定会对底物的断键和新成键产生影响(这个做过化学反应的人都知道)。二来,温度和pH会对蛋白的结构稳定性,甚至是结构本身造成影响。因为,蛋白质的三维结构的稳定力主要靠的是侧链不同电负性氨基酸残基的相互作用平衡,一但系统温度或者离子强度或者电性发生改变,必然结构要发生改变。要找出相对准确的影响,需要分析两者的平衡,简单的不同温度、pH的动力学似乎很难准确模拟。总之,这个还是非常难。不过不要气馁,越难越容易出成果。大家加油!
发表于 2013-1-4 16:51:00 | 显示全部楼层
如何在非水相体系中进行酶催化的模拟呢?

这个要看你的体系到底是什么了。两个关键问题:一个是溶剂分子的构型和力场。比如水:就有好多人提出的好几种:TIP3P、TIP4P等等。另外,溶剂分子的分布和盒子构建。需要根据溶剂特性分析和设计。很多东西甚至要自己去写的,很麻烦。另外,还可以根据你的溶剂的特性,类似水一样,做显性或者隐性模型。
 楼主| 发表于 2013-1-6 22:04:48 | 显示全部楼层
其次,针对我们酶学工作者,这些模拟手段都能用于什么实际问题的解决呢?1.  我想知道我的蛋白结构 ...

其次,针对我们酶学工作者,这些模拟手段都能用于什么实际问题的解决呢?1.  我想知道我的蛋白结构和别人的有多相似,活性位点的差异,有木有这个家族共同的结构特征?请用同源模建张老师意见:酶的家族最保守的特征应该是催化中心吧。是否具有这个家族特征最好用blast与同家族的蛋白在序列上做一下比较吧。同源建模是利用了别人的结构做的参照,相似部分照抄(那对于比较是没有意义的)、不同的部分是loop区,还要做renfine。因此,同源出来的可能比较粗糙。然后需要做结构叠合等,也只是给一个参考,不能依赖。总之,比较难。我的意见:谢谢张老师的讨论,其实BLAST是同源模建的一个必须过程,因为同源模建的质量高低很大程度上取决于序列比对的可靠程度,对于序列一致性高的两个蛋白,blast就足够了,如果序列一致性不是这么高,比如接近于30%,我们就需要考虑利用一些更为敏感的比对手段,比如PSI-BLAST等等。我在这里强调的是同源模建对于未测定结构的蛋白的特性的辅助说明能力,其结果的可靠性与操作者个人水平,采用软件的组合等均有很大关系,总之,同源模建方法在辅助说明性质上绝对有其用武之地,不敢苟同张老师的意见。2.  我的酶对底物A作用好,对B不好,为什么?请用同源模建+分子对接+分子动力学(如果条件允许)张老师意见:酶对底物的催化效率问题其实是非常复杂的问题。对A好而对B不好有可能是很多因素造成的。如果是AB间结构差异(这个是最简单)那分子对接也许能找到一些规律,但是如果是AB本身差异呢?比如需要反应的化学键周围差异原子对化学键的影响?这个可能要从量化角度考虑。所以,这个问题要因对象而异,要全面思考。总之,比较难。本人意见:张老师您说的很对,对于底物选择性的差异我们一定要具体的分析主要的原因是什么,是Km的巨大差别还是Kcat的巨大差别,km的差别可能利用docking+MD就可以做简单的解释,而kcat的差别就一定需要结合量化才能考虑。3.  我的酶催化反应的机理是怎么样的呢?请用量化计算张老师意见:酶催化反应的量化计算至今仍然是难题。其中需要解决的问题太多。首先,全体系量化无法做。做QM/MM如何切割QM部分?交叉部分能量如何计算?切割开以后的键如何饱和等等。其次,如何确定反应路径?如何知道你计算的反应路径是最速反应路径?如果你计算了半天,你找到的路径是低概率路径,那不是白干?所以,这个问题几乎不可能直接要计算来解决。要结合很多实验。总之,特别难。本人意见:我们在这边所有的议题实际上都是给一些被迫从事计算模拟用于说明实验问题的同学一点指导,解决问题的可能性和困难度并不是一回事,难并不意味着不能解决,只是需要更多对自己的体系的了解以及对计算软件的熟练掌握,如果一开始就存在畏难情绪,那么所有计算都可以不用开展了。但是需要结合实验数据也是我非常赞同的,我也和张老师说过,我做的是semi-rational design,虽然现在还不成熟,但是我会继续努力!4.  我的酶突变了一些残基后,底物活性/选择性变化了~怎么解释?同源模建+分子对接+分子动力学张老师意见:一个或两个点的突变,在结构上有可能会造成蛋白质整体结构的很大改变,甚至导致无法正确折叠,不能形成可溶蛋白(这也是设计了突变看似合理但是往往没有活力的原因)。而同源出来以后,往往rmsd值差异接近0。如何保证获得真实结构?残基的突变与底物活性、选择性质的改变,有可能是影响的结构、结合口袋的构象,影响了空间或者电性,也有可能是影响了底物进入的通道,也有可能是影响了催化中心的电极性,影响催化中心关键原子的亲电或亲核进攻。如何分析?似乎还得因题而议。总之,这个很难。本人意见:同源模建并不是用于直接区分突变对于整体构象的影响,而是为了获得一个可能的突变体结构。真正需要区分突变体的效应,可以结合分子对接和MD来进行说明,模拟本身就不可能保证获得真实结构,即使是结晶得到的结构也只能说是某时刻的结构,蛋白质本身就没有真实的结构一说。对于突变体的效应确实是有可能有多种影响因素,底物通道,催化机制以及空间位阻等都是有可能的因素确实是需要深入分析。5.  我想重新设计一下我的酶的底物结合位点,使其作用于底物A,B的活性发生反转?同源模建+分子对接+分子动力学+Rosetta张老师意见:此题同上。另外,同源建模与Rosetta应该是一回事吧。都是用来构建模拟的吧,只是原理不同而已。总之,这个也很难。本人意见:rosetta和同源模建完全不是一回事,rosetta是个完整的酶设计软件包,包括模建,对接和直接设计等多个package.其直接设计的策略是否可靠是另一个话题,需要对其的评价函数不断修正才有可能能得到比较普适的设计评价函数,比如现在只能考虑位阻,那么针对位阻对底物的影响较大的反应可能就会有比较理想的效果,反之则不然。6.  我的酶做了突变想热稳定性和酸碱耐受性变化了,如何模拟?同源模建+分子动力学(不同温度/pH)张老师意见:温度和pH对于酶性能的影响,至今众说纷纭,没有权威论断。我个人认为其实是两个问题的平衡。一个对于化学反应来说,温度和pH一定会对底物的断键和新成键产生影响(这个做过化学反应的人都知道)。二来,温度和pH会对蛋白的结构稳定性,甚至是结构本身造成影响。因为,蛋白质的三维结构的稳定力主要靠的是侧链不同电负性氨基酸残基的相互作用平衡,一但系统温度或者离子强度或者电性发生改变,必然结构要发生改变。要找出相对准确的影响,需要分析两者的平衡,简单的不同温度、pH的动力学似乎很难准确模拟。总之,这个还是非常难。本人意见:张老师的这个观点我非常赞同,虽然看到有做不同温度和pH的模拟的,但是可靠程度高低是值得仔细考量的,可以进一步探讨交流!不过不要气馁,越难越容易出成果。大家加油!
发表于 2013-1-7 08:09:09 | 显示全部楼层
嗯。阿里开的这个帖子很有意思。我觉得可以大家来深入讨论一下。希望能给大家一下帮助。一次讨论很多的方向比较难,我们一个一个来吧。首先来谈谈阿里说的第一个问题:关于结构相似、活性位点差异和家族共同特征:首先要谈几个概念:第一,酶的分类如何分?什么是家族?这个问题我觉得现在很多人还是比较模糊的。对于酶的分类,应该有两个大的系统。一个是EC的分类系统,这个是针对与酶的功能的分类,建议关注功能的人尽力多关注这个系统。另外一个是基于基因序列建立的同源性分类方法,研究进化的人可能更加关注这样的分类。这两者其实既互相关联,但也有矛盾的地方。比如,基因的同源性分类中,会认为,如果两个酶同源性越高,可能他们的亲源性越高,是同一家族。但,在功能上,有可能99%基因一致,但是功能确差别很大。也有可能序列完全不一样,但功能却完全一致(同功酶)。所以当我们在谈酶的分类、相似性、家族时,一定要考虑清楚我们是基于功能还是序列来分类。第二、结构与活性位点的关系。事实上,一个酶的结构中99%的蛋白是不直接参与酶的化学反应的。一般来说,只有几个氨基酸构成一个多联体,这个多联体在序列上是不连续的,在空间上却是靠的非常近的,而且这几个氨基酸一般都是带点性的氨基酸,这个的带点氨基酸实现了一定的排列以后构成了一个非常特殊的空间电场环境,从而实现亲电或者亲核进攻,进而完成化学反应。同时,有一个或者多个氨基酸与底物关键原子作用,改变底物的电子云构型(最常见的是氢键),方便实现反应,这也是降低反应势能垒的物理学本质之一。因此,我们把那少数几个直接参与化学反应的氨基酸称为催化中心。比催化更大的一些的功能结构,我们称之为结合口袋,这个口袋中的氨基酸直接与底物产生非键作用(当然也可能包括一些氢键或者盐桥等更强作用),进而影响酶的底物选择性质。除此之外的全部氨基酸都是为了维持酶的空间构象的。所以只要能保证那几个关键氨基酸的位置正确,不论其他的氨基酸如何改变,都能完成催化反应。这也是在同一功能家族的酶的催化中心一般都是高度保守的原因。这也是我在解释分析酶的家族特性的时候(这里指的是功能家族),建议大家用blast分析的原因,这个和同源建模是的blast还是有区别的。我们可以把几十条功能一致的蛋白序列一起做比对(可能我上次没有说清楚,其实应该是多重序列比对,但是基本思路和方法是一致的,所以我就简单的称为blast,可能造成了误会)。这个分析以后可以找到你的酶的可能的催化中心(就是那些在很多条基于序列中都高度保守的氨基酸)。特别是当你参与比对的氨基中有一些是催化中心已知的时候,就更加可以参考别人的工作来做判断。顺便提个问题,我们比对出了这些氨基酸以后如何确证?第三、关于同源建模。同源建模,顾名思义就是根据源头的结构来建模。同源建模的软件很多,但是其基本原理都是一致的。首先,必须要找源,就是在pdb数据库里找到与你的模板蛋白序列同源性最高的蛋白结构(这里也要用blast,这个就是阿里说的那个blast),然后参照其结构构建那的模型。如何构建?就是在序列与结构之间建立一个固定的对应关系,其实是一个数学的映射,不同的软件做的函数处理可能各不相同(有兴趣的话可以参考modeller的手册)。同源建模其实是很死板的,只要稍微注意一下基本策略(比如尽力多找几个模板、要找不同部位同源性较高的结构做模板等),出来的模型都可以接受。但是同源出来的模型一般有两个问题,第一,相对可信度还是较差的,第二,其实还有很多loop区没法处理的。一般还需要做做处理,比如具体loop renfine,整体能量最小化,加水的动力学平衡然后能量最小化。但不管怎样,你只能做大致的观察,而不能做详细的分析。这也是很多高水平论文都不认可同源模型的分析结果的原因。当然,这个的用处还是要因课题而异。我个人认为,对于搞药物设计和代谢研究的人来说,还算可以,因为他们研究底物与结合口袋的作用,而对于搞酶催化研究的人来说,要谨慎对待同源模型,因为他们要求的更加精细,需要关心催化中心,而这个对于结构更加敏感。好的。今天太晚了,改天继续,欢迎拍砖头。
发表于 2013-1-6 22:04:00 | 显示全部楼层
非常精彩,期待
发表于 2013-2-20 15:50:10 | 显示全部楼层
阿里学长,这个I-TASSAR服务器的主页是这个么http://www.tradera.com/ovrigt-c3_340938
发表于 2013-2-20 15:55:01 | 显示全部楼层
真心没有找到I-TASSAR服务器主页,汗汗汗
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