HPLC测定化合物溶解度实验

川大-灰太狼

HPLC测定化合物溶解度实验

优点：此实验特别适用于测定纯水中难溶化合物的测定！

大家在做药物Me-too改造时，通常会合成一系列化合物，其中不乏有些在水溶液中难溶的化合物，但酶活性很不错。如果采用药典标准的溶解度测定方法，将很难测定难溶性化合物的水中溶解度。因此实用的一种方法是借助实验室现成的HPLC来测定化合物的溶解度。

缓冲溶液：磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。

在10mL具塞试管中加入略过量的高纯度化合物，加入7mL左右的溶剂，保证在实验过程中试管里始终存在少量固体。盖上试管塞，试管口用封口膜和Teflon带分别缠绕封口，防止溶剂挥发。每种溶剂设置两个平行试管，放入恒温槽(精确度为士0.05℃)中，先超声30分钟，再搅拌6小时后静置36h，保证固液相达到平衡。用洁净并且预热的注射器和针头，从试管中取出(0.1-0.3)mL上层清液，针头插入硅胶垫以防止溶剂挥发，放入分析天平中称量，得质量W1(g)。将注射器中溶液快速注入10mL容量瓶中，针头同样用硅胶片封口，再次称量注射器得到质量W2(g)，计算得到饱和溶液质量W0=W1-W2。每个试管取三个平行样。容量瓶中的饱和溶液用甲醇（或者流动相）稀释合理倍数，相当于稀释至P mL，用HPLC检测其浓度C (mol/mL)。(HPLC参考条件：反相色谱分析柱；检测波长为303nm；流动相为乙睛：水=40：60；流速为0.8mL/min)。Wm为化合物分子量。

化合物溶解度m (mol/kg)的计算公式为:

后面可以换算为mg/ml
注意要点：1、温度 ；2、充分溶解；3、进样前用流动相稀释

不足之处还请大家指正和补充！

中科院-石头

1. 简单的说，配成饱和溶液，测定上清液的浓度就可以了？
2. 如果为了节省样品量，是不是不一定要按这个标准做，比如少加点溶剂？
3. 另外，恒温槽和HPLC系统的温度应该不同，这点温差，对测定结果影响大么？

川大-灰太狼

中科院-石头 发表于 2012-10-31 14:08

                               
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1. 简单的说，配成饱和溶液，测定上清液的浓度就可以了？
2. 如果为了节省样品量，是不是不一定要按这个标 ...

呵呵 石头的问题很好！
1、恩饱和溶液或者过饱和溶液。振荡搅拌主要是让固液两相尽可能的到达最高的平衡稳态。
2、根据实际情况做，节省样品。
3、进入HPLC之前需要用流动相稀释，这样就保证饱和或者过饱和溶液在HPLC中不会析出，也不受HPLC温度的影响。

PS：温度对溶解度的影响是较大的。

对于任何实验，最好在做预实验的时候就确定好标准，验证实验方法。然后再进一步做实验！当然仅仅是需要一个初步的溶解度结果，这样直接做也是可以。

中科院-石头

川大-灰太狼 发表于 2012-10-31 14:25

                               
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呵呵 石头的问题很好！
1、恩饱和溶液或者过饱和溶液。振荡搅拌主要是让固液两相尽可能的到达最高的平衡 ...

多谢了~~

川大-灰太狼

：）我也只是一点经验，与大家分享下，其中肯定还有问题，还请大家指正。

中科院-石头

你这个方法有没有文献标准操作参考呢？类似文章后面的supporting information部分那样的步骤。
另外，推荐你看看这个网站 http://www.cyprotex.com/admepk/p ... dynamic-solubility/
虽然是公司网页，但是列举的一些涉及体外ADME/PK检测的方法和解释，还是可以学到不少东西的。

SYPHU_me

严谨程度如此之高，感觉你像是做分析专业出身，不像是做CADD的，赞一个！果断收藏学习O(∩_∩)O哈哈~
下面有两个问题向LZ请教一下：
1. 在进行该化合物相应酶学测试时应该使用与之相同的溶剂吗？
2. 你配的缓冲溶液的pH大概多少，是用pH计测的吗？还是直接购买的。
3. 如果化合物的纯度是100%，貌似这个测定浓度只和其Wm成反比啦，是不？
有空指导一下嘿嘿

川大-灰太狼

SYPHU_me 发表于 2012-10-31 19:48

                               
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严谨程度如此之高，感觉你像是做分析专业出身，不像是做CADD的，赞一个！果断收藏学习O(∩_∩)O哈哈~
下 ...

1、酶学测试的时候一般还是用的0.1%的DMSO。
2、pH=7.4，是直接购买的国产试剂。
3、化合物纯度不可能是100%吧！

SYPHU_me

川大-灰太狼 发表于 2012-10-31 20:54

                               
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1、酶学测试的时候一般还是用的1%的DMSO。
2、pH=7.4，是直接购买的国产试剂。
3、化合物纯度不可能是100 ...

恩，嘿嘿

SYPHU_me

SYPHU_me 发表于 2012-11-1 11:28

                               
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恩，嘿嘿

但DMSO的通常用量要控制在千分之零点五以内，要不然对活性结果可能有影响，不过肯定会加空白对照啦