蛋白晶体结构解析之-目的基克隆及载体构建篇

浙农林—老张

本帖最后由 浙农林—老张 于 2012-11-9 09:19 编辑   每当看到PDB中眼花缭乱的蛋白三维结构，出人意料地绽放在nature、cell、science。。。的时候，心里总有些羡慕：“哇，好棒”，但更多的是充满疑惑：这些“奇葩”是怎么做出来的？ 对于像我这样半路出家做生物的人而言，面对蛋白结构生物学这一高深莫测的研究领域， 要解析出一个蛋白或酶的空间结构感觉比登天还难，往往力不从心，无从下手。 偶然的机会，在高人的引领和指点下，决心转行进入这一陌生的领域，开始相关蛋白结构生物学的研究。　　要做出一个蛋白生物大分子的结构，回想起这两年的经历，把一些思路和注意事项做一粗略的总结，不当、不完整之处还要大家多包涵，也欢迎群友补充完善。蛋白晶体结构解析之---目的基因克隆及载体构建篇　　要做蛋白，通常要用到反向遗传学的手段，从编码蛋白的基因入手，克隆基因后让其在宿主细胞中表达，从而得到用于结晶的蛋白材料。  这部分实验主要包括诸如PCR、PCR产物纯化回收、连接转化等，均属于常规分子生物学实验范畴，具体步骤不做详细说明，应该可以轻松拿下。重点说一下这一过程要注意的事项。这部分关键有二，一是是候选基因的确定、其次是载体和宿主细胞的选择。候选基因通常不是选一个两个，而是要选择多种不同的基因，做海选，最终确定研究的目标。当然，通常情况可以根据文献，选择你认为重要的有研究价值的一系列基因，或者也可以选一个pathway中的不同基因作为研究对象，这样做的目的，其实不说大家也很清楚，做蛋白结构，成功率比基因克隆那是低了很多倍。所以，要跟上后基因组时代的潮流和步伐，想要在短时间内做些蛋白结构出来，防止吊死在一棵树上，候选的目的基因尽可能范围要大。　　　根据有关的报道，在现有技术水平下，假如你做100个基因，最后能得到的20个左右的晶体结构，就很高效，很lucky了，往往更时候会出现相反地令人沮丧的情况：做到吐血，都没有得到任何晶体结构。如果是一个要想靠解析蛋白结构完成学业的学生，那在选题前建议大家要做一些基因的“海选”，可以防止不能毕业或不能按时毕业的风险发生。倘若已经确定做某一具体蛋白，没有更大自由度做“筛选”，也有一些策略供参考。若做完整蛋白结构有困难，那就做部分重要特征结构也可以，这种列子在PDB数据库中不胜枚举。譬如可根据相关文献，或者生物信息学分析，做一个重要结构域的三维结构，这就要求你在候选基因的时候要做适当的生物信息学分析。不过有时候你会碰到结构域由一些疏水性氨基酸组成比如一些跨膜结构域（TM），或者二级结构预测片段可能存在loop区，那在构建载体的时候尽量避开这些今后影响晶体形成的因素。（当然这不是绝对的，经常见一些顶尖的文章往往是做这些跨膜蛋白结构的，我们经常戏称这些蛋白为难啃的骨头，做这些”骨头“的时候有风险当然也可能会有意想不到的收获哦）。　　　在对手头若干候选基因做后续试验之前，先要明确该基因编码蛋白有无重要价值，PDB中有无类似同源结构，这就需要你查相关文献和PDB来明确。接着做一个生物信息学的分析，主要是看下候选基因编码蛋白的亲疏水、细胞内的半衰期、二级结构等一些理化性质。　　　一般而言蛋白亲水性强，半衰期长，即较稳定，则后续诱导表达尤其是纯化等成功的把握性越大。上述可以用DANMAN等本地化或在线expasy.org中相关ProtScale、ProtParam等工具来预测分析。还有一个网址推荐给大家，可初步分析预测蛋白结晶可行性：http://bioinformatics.anl.gov/cgi-bin/tools/pdpredictor/ 　　　其次，选择表达载体时，尽量选择带GST、HIS、MBP等标签的载体，方便后续蛋白纯化实验。北京一家公司还推出了一款pEasy 表达T载体（带His），PCR直接连进去就可做诱导表达了。本人测试只需要花3天工夫就可初步知道你的目的基因是否能表达，方便！。当然可能还有更好的选择是一个T表达载体带双亲和标签如HIS+GST（这种T双亲和标签的载体目前市面好像还买不到哦，谁能开发出来？保不准能挣大钱!），这样后续纯化是否更简洁呢？（但据说，2个标签会引起后续表达蛋白的不可溶，有点费解，期待大家验证。）　　　由于表达载体种类比较多，在后续构建重组克隆时，还需注意的一个问题是是如何引入酶切位点，因为多数重组克隆是通过PCR、酶切连入载体的。所以，在前期PCR引物设计时，需根据载体图谱和产物酶切图谱要引入相应酶切位点（包括还有加保护碱基，主要方便后续酶切实验，保护碱基的加入可参照NEB有关保护碱基的选择，不展开），这里推荐VectorNTi来做相应引物及酶切位点的设计。　　　下面再说说宿主细胞，通常有几种宿主细胞可供表达所用。主要有大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞，枯草芽孢杆菌细胞、家蚕等，当然动物、植物细胞也可用做宿主细胞。其中最为常用的当首选大肠杆菌表达系统，优点不言而喻，大部分蛋白表达包括真核生物以E.coli作为宿主细胞进行表达基本都是可行的。大肠杆菌细胞Strain很多如常见的JM109\DH5α\DH10B\BL21\BL21（DE3）\BL21(PLYS)等很多,用于表达的多是BL21系列的，诱导表达时注意宿主所携带的抗生素抗性。若遇到目的基因不表的的情况时，可考虑更换表达的宿主细胞。其他几类细胞，可做替补，譬如某些真核细胞基因表达在大肠杆菌中出现包涵体或者遇到无法克服的困难时，可考虑换成酵母、昆虫等其他的表达系统来做尝试。当然这些替补队员是否有出色表现，因蛋白而异，因人而异。  

北京-构效

默默的学习一下，我是刚转行做药物分子设计，深刻理解换一个领域的不容易，好在有这么多志同道合的朋友，顶一个

西大-song

老张哥发帖了呀，围观一下。标签我们一般选在结构域少的那一侧。那公司当初给我们也推荐过他们的TA克隆表达载体

                               
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，其实平时我们表达时候也是pcr结束直接TA克隆，测序完成切TA克隆载体上的酶切位点，连表达载体表达，这样也挺省事的。

川大-灰太狼

老张哥详细的描述和幽默的表达让我这个门外汉受益匪浅呀！支持老张哥的原创文章。

guoyingnba

                               
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顶！

ToxicDolphin

那这种pEasy 表达T载体有什么好处呢

浙农林—老张

PCR完了直接装进去就行。但是别忘了PCR验证插入方向。

霁风

谢谢分享经验，收益匪浅。

jiangcj0520

学习了丫！多谢了咧！

                               
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ottolzm

谢谢楼主的分享