蛋白晶体结构解析之-蛋白结晶方法的选择

浙农林—老张

本帖最后由 浙农林—老张 于 2012-11-26 11:15 编辑 有部分参考网上的资料，呵呵。• 蛋白结晶方法(Crystallization Techniques)的选择。分批结晶(BatchCrystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂。液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。蒸气扩散（VaporDiffusion）  悬滴法（TheHanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封。该方法最为常用。晶体生长的基本装置是Linbro多孔组织培养板及用二甲基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料盖玻片。悬滴法具体操作步骤：第一步, 在作结晶实验之前，最好对蛋白质样品进行离心， 以除去不溶解的蛋白和杂质,以减少不必要的成核中心, 此外，对蛋白质样品进行超滤，也是值得推荐的。第二步, 采用“吹气法”除去培养晶体用的组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘。第三步，在组织培养板的孔中加入0.2 - 0.5ml经过超滤的含沉淀剂及添加剂的缓冲液,作为池液, 孔边缘涂上真空脂。 第四步, 吸0.3ul或0.5ul池液放到硅化后的盖玻片上, 加等体积蛋白溶液至此池液上 (这个体积比将决定平衡后的蛋白质浓度)，混合均匀， 应避免气泡出现，一般不要去用枪吸吹，蛋白样加进去就OK。第五步, 翻转盖玻片盖在孔上, 检查密封是否良好。 上述方法中步骤2和4目前己可在自动化仪器中进行, 但是, 绝大部分拥有该仪器的实验室最终还是乐意采用手工方法。起始的条件实验常在感兴趣的区域(通常低于沉淀蛋白所需的浓度)进行，然后再进行实验条件的优化。一般的,蛋白质晶体生长所需的硫酸胺等沉淀剂浓度在理想浓度的1%或2%偏差范围内, 但对于不同分子量的聚乙醇胺（PEG）则可宽松一些。 晶体在数小时至数月后出现。 通常，微晶可用作晶种接种后以长出更大的晶体。蒸发扩散结晶的另一种形式是坐滴法（TheSitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利。坐滴中含池液和蛋白溶液各1－2ul。 此方法对于以下情况非常适用：即使用非离子去垢剂作为添加剂表面张力较低时；或用聚乙二醇或乙醇作为沉淀剂 (由于凝结等问题, 悬滴体积趋于增大)时；反向扩散导致液滴增大时；或结晶条件已确定, 需要大量晶体时。QQ截图20121126111122.png(60.13 KB, 下载次数: 0)
2012-11-26 11:12 上传
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浙农林—老张

本帖最后由 浙农林—老张 于 2012-11-26 11:20 编辑 　　以上2种方法是最为常用得蛋白结晶方法，亦可可用于结晶条件的筛选。相关的耗材入24、96、384孔板国产的就可以满足了，没必要买进口的。我实验室用的是24孔板（类似细胞培养板），再买点盖玻片就可以了。  透析法（Dialysis）除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于0.1ml），可用透析管完成。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约10min。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Zeppezauermethod）或者树脂玻璃纽扣。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。另一中微透析方法，将5μl蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Eppendorf管中。　　其他方法：看下这个有趣的用注射器来做比较大的晶体的，也很有意思。上述结晶方法多数实验室采用座滴法或悬滴法。省事点的就直接悬滴了。结晶的试剂盒多用hampton的，但买原装的太贵，就直接按其公布的配方自己配制了。关于蛋白纯化部分，是整个蛋白结构生物学的关键步骤。相关的文献有不少，但每个蛋白纯化的方法都不一样，故没有固定纯化模式可遵循。基本是首选亲和层析/离子交换/分子筛配合来纯化。当然结晶也是个纯化的过程，故对于有些蛋白也不需要100%的纯度，可能大于50%的纯度，幸运的话也可获得晶体。好了，后续晶体质量是否过关，只有去衍射了。悲催的事也经常碰到，晶体要不长不大，要么长的还好衍射不行，只好蹉跎岁月，权当好事多磨。所以做蛋白结构要有耐心、细心、恒心。（我曾一度就想过要放弃，哈哈）。

guoyingnba

悲催的晶体组啊，抑郁。老张哥写的还是学到很多，支持。

tanxijuan

支持，知识量到位啊