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标题: 方兴未艾之时的不可逆蛋白激酶抑制剂 [打印本页]
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-6 19:16
标题: 方兴未艾之时的不可逆蛋白激酶抑制剂
方兴未艾之时的不可逆蛋白激酶抑制剂
The Resurgence of Irreversible Protein Kinase Inhibitors
不可逆抑制剂并不是一个新的概念，在药物研发历史中发现的不可逆抑制剂有，阿司匹林、青霉素和06年销售量top20的奥美拉唑、氯吡格雷等。在他们被广泛使用和研究后，才发现作用机理是通过体内活性代谢物与靶标形成共价键，不可逆地抑制靶标活性。而且，这一滞后被发现的不可逆机理，也给药物化学家在设计药物分子方面，提供了新的思路，即通过引入活性片段（通常是亲电基团）达到与靶标共价结合的目的，从而提高活性。
在蛋白激酶抑制剂中，这种能与活性片段（warhead）结合的靶标残基有两种：赖氨酸（Lys）和半胱氨酸（Cys），其中，Lys的氨基可以与小分子的易离去基团发生亲核取代反应，Cys的巯基则可以与小分子或发生迈克加成反应或形成二硫键等。（见图1）
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图1
不可逆蛋白激酶抑制剂有什么优点呢？最显著的优点就是，对靶标的活性强，一旦药物分子历经口服（或注射），肠壁吸收，首过效应，血浆代谢等重重关卡到达靶标组织与靶蛋白结合后，抑制活性将不再依赖于血药溶度（AUC）、半衰期（t1/2）等药动数据。因为不可逆小分子的结合，将使被结合的靶蛋白永久失去生物功能，而机体只能通过自身新陈代谢重新生成靶蛋白来恢复本身的功能。这样一来，又会带来另一个问题，即毒性问题。因为，一旦药物分子的warhead错误地结合了非靶标蛋白（off-target），将会影响正常的生理功能。带着这个问题，通过后面的例子可以看出解决的思路。
如果按可被共价结合的Cys在蛋白激酶结合口袋的位置分，可以把目前的不可逆蛋白激酶抑制剂分为6类，分别是Group1（P-loop区），Group2（β2折叠区），Group3（铰链域），Group4（β8折叠区），Group5（A-loop区），Group6（Gatekeeper区）。（见图2）
[attach]180[/attach]
图2
以Group1B中的FGFR抑制剂FIIN-1为例，从图3左边可以看出，落在该区域的靶蛋白有FGFR，YES，Src，YNK1等，如果能够设计一个小分通过与Group1B处的Cys共价作用，不仅能获得高活性分子，而且能达到与其它区域蛋白的选择性（解决off-target问题）。该分子的设计者以FGFR可逆抑制剂PD173074为出发点，通过观察晶体结构，发现在母环朝向Cys484的位置可以引入丙烯酰胺片段（warhead），或许可以找到新的不可逆抑制剂，于是进行了不同的尝试得到化合物1（活性降低300倍）、化合物2（活性增强）、化合物FIIN-1（选择性进一步提高，其实这里基于原来可逆抑制剂的选择性设计策略，也同样能提高不可逆抑制剂的选择性，进而解决off-target问题）。
[attach]181[/attach]
图3
上面这个例子讲到了，通过提高选择性来解决off-target带来的毒性问题，如果从药物化学的角度来讲，具体的策略有两条：一是通过探索母核结构的多样性，个人认为不同的激酶对某些特定的结构具有选择性（优势结构设计策略），比如EGFR与喹唑啉、嘧啶母核抑制剂匹配，VEGFR与脲类结构匹配，这个母核结构的本质是ATP腺嘌呤结构的生物电子等排。二是通过微调活性片段（warhead），或基于化学知识调整活性片段的反应活性，或采用不同linker来连接warhead和母核。
最后，再抛出一个问题，希望和大家讨论。传统的对接方法对可逆抑制剂比较适用，但是，对于这类不可逆抑制剂与蛋白的结合模式，采用什么计算模拟手段可以预测和评价结合的强弱？
作者: mengguren527 时间: 2012-11-6 21:25
拜读拜读沙发
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-7 09:20
板凳
好棒的文章哦，抛出的问题也是那么的给力，赞！期待对接高手给予讨论解答。
仔细阅读后向你请教。
作者: 浙医-中药筛选 时间: 2012-11-7 10:01
{:soso_e179:}{:soso_e179:}围观高手！
作者: 川大-灰太狼 时间: 2012-11-7 10:51
首先，就石头兄上述说的FGFR抑制剂FIIN-1中引入共价键如何达到选择性的我还不是很明白！就是因为与CYS形成共价键就有了选择性？那这个双键的尾部可以与其他蛋白的CYS形成共价键吗？比如erbB家族的蛋白，也有活性口袋旁也有CYS。
以下是激酶类的共价键抑制剂，如下图.
[attach]193[/attach]
其次，对于石头兄提出的共价键对接的问题，其实软件GOLD，Schrodinger的Glide都是可以实现的！但目前对接的软件的打分函数还不能很好的处理这个问题，因此仅仅可取的是对接后的构象！当然，有了这个构象，就可以用高斯量化软件研究反应的过程了。
[attach]195[/attach]
这将有助于研究共价键的形成。
当然，这仅仅是一种研究思路，欢迎大家提供更多的研究思路！
PS:附件中为研究激酶类共价键抑制剂的一篇文献和石头兄撰写文章的nature review。
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-7 12:31
川大-灰太狼 发表于 2012-11-7 10:51
首先，就石头兄上述说的FGFR抑制剂FIIN-1中引入共价键如何达到选择性的我还不是很明白！就是因为与CYS形成 ...
1. 一般情况下，不可逆抑制剂在结合口袋中的构象、位置与可逆抑制剂是类似的，这样才能基于可逆抑制剂的结构进行合理的引入warhead。FIIN-1中的丙烯酰胺片段，朝向P-loop上的Cys484，而erbB家族蛋白在相应的位置没有Cys存在，因此，FIIN-1不能和erbB家族蛋白共价结合。而且对于erbB家族蛋白来说，额外增加的这一片断，不仅不能形成共价键，反而从弱相互作用力（氢键，疏水作用，范德华力，结构匹配）来说也是不利的。而你列举的erbB家族抑制剂中的丙烯酰胺，朝向hinge区的Cys797，同样在该位置FGFR也是没有相应的Cys存在。
2. 正如上面的所提到，额外引入的warhead往往对于弱相互作用是不利的，如果不是因为共价键强，小分子的优势结合构象也将不是适合共价键形成的构象。因此，通过对接软件出来的结果，实际的结构构象很可能排在后面，甚至不出现。
3. 你所列举的两篇文献正是我主要参考的文献，由于还参考其他文献，并且不记得相应内容的出处，就没放附件中。其他如果感兴趣的朋友，可以来下来看看。
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-7 13:54
川大-灰太狼 发表于 2012-11-7 10:51
首先，就石头兄上述说的FGFR抑制剂FIIN-1中引入共价键如何达到选择性的我还不是很明白！就是因为与CYS形成 ...
Canertinib是第一个上临床的不可逆激酶抑制剂，但由于它血小板症减少的副作用终止于二期临床试验，但这个为后来的不可逆激酶抑制剂提供了模板，比如Neratinib。另外，这两个结构中有涉及到氰基是azomethine-H2O的生物电子等排体的设计思想。我想，狼哥注意到这点了嘿嘿！
如果得到并提取的构象不太准的话，那么后面的分析就没用了吧！这个提取构象的过程是不得靠个人的经验啦。。。。。。
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-7 14:10
石头，下面这个几个问题，请教一下嘿嘿！
1. 只有Lys、Cys是不可逆抑制剂结合的靶标吗？就Lys而言，从作用机理看，是结构中的羧基负离子去亲核吧，为什么是Lys被点名，它的特别之处是什么？另外，就Cys而言，有没有可能GSH或者是TrxR与这种不饱和酮作用啦。
2. 如果活性口袋处的CYS不在你提到的那六个地方，是不也有可能形成共价复合物？
3. 判断是否是不可逆抑制剂，那么在前期如何才能早发现呢？
4. 就这种抑制剂而言，如果是PO，只吸收一点，那么你觉得有进一步开发的价值吗？给我感觉这种抑制剂研究PK没多大用啦。
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-7 14:13
中科院-石头 发表于 2012-11-7 12:31
1. 一般情况下，不可逆抑制剂在结合口袋中的构象、位置与可逆抑制剂是类似的，这样才能基于可逆抑制剂的 ...
如果是共价相互作用，就没有弱作用了，是不？为什么不能同时存在呢？
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-7 16:04
还有就是，一般形成共价键的可接受距离范围是多少，看了一下FIIN-1那个是2.9。
另外，假如我想找CYS在hinge区的所有激酶有哪些该怎么找呢？
谢谢O(∩_∩)O~
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-7 17:54
SYPHU_me 发表于 2012-11-7 13:54
Canertinib是第一个上临床的不可逆激酶抑制剂，但由于它血小板症减少的副作用终止于二期临床试验，但这个 ...
Neratinib在非小细胞肺癌的二期临床也因为剂量依赖毒性终止，不过转而做乳腺癌，现在处于三期。目前最有期望的是Afatinib。
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-7 18:12
本帖最后由 中科院-石头 于 2012-11-7 18:42 编辑
SYPHU_me 发表于 2012-11-7 14:10
石头，下面这个几个问题，请教一下嘿嘿！
1. 只有Lys、Cys是不可逆抑制剂结合的靶标吗？就Lys而言，从作用 ...
1. 根据文献的原话“To our knowledge, there are no reports to date that describe covalent kinase inhibitors that adduct other amino acid residues, such as serine or threonine."目前只有Lys和Cys。Lys结构特点是具有一个柔性脂肪链连接的氨基，脂肪胺的亲核性比较高。此外，并不是所有具有不饱和酮的化合物都能和蛋白中的Cys反应，也要看分子与蛋白的匹配性。一般，针对GSH谷胱甘肽，谈及的更多是，它与不可逆小分子之间的反应，从而引发的毒性或代谢问题。
2. 理论上是可以的。
3. 验证不可逆机制的方法有生物质谱，点突变和晶体解析。但是，早期可以通过简单的激酶活性测试来初步判断。通常我们测试激酶活性，是先将小分子抑制剂、激酶、底物孵化一段时间，再加入ATP进行1.5小时的反应，根据底物荧光共振的变化来确定IC50，但是不可逆抑制剂的IC50,随孵化时间增加而降低，而可逆抑制剂的IC50并不明显受孵化时间影响。
4. PO低，对药物的成效性是很大的影响，口服是最简单安全的给药方式，如果，通过静脉注射、舌下含服、直肠给药等等方式，都会带来一定开发难度，进一步开发的价值将大大受限。因此，需要从具体的PK数据来分析口服吸收低的原因，可以围绕着溶解性、穿透性、代谢稳定性来对抑制剂进行结构改造。
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-7 18:26
本帖最后由 中科院-石头 于 2012-11-7 18:44 编辑
SYPHU_me 发表于 2012-11-7 14:13
如果是共价相互作用，就没有弱作用了，是不？为什么不能同时存在呢？
两类作用同时存在的。不可逆抑制剂是基于可逆抑制剂的前提额外增加的一个更强的结合键，共价键得以形成，必须首先依靠它与蛋白之间的弱作用力进行结合，这是可逆的过程，然后再形成共价键。我回复狼哥的帖子，是想表达如果引入的warhead片段周围没有Cys存在，那么这个warhead岂不多余，在已经做过SAR得到的分子上平白引入一个片段，通常还是会降低活性的。
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-7 18:27
本帖最后由 中科院-石头 于 2012-11-7 18:45 编辑
SYPHU_me 发表于 2012-11-7 16:04
还有就是，一般形成共价键的可接受距离范围是多少，看了一下FIIN-1那个是2.9。
另外，假如我想找CYS在hinge ...
1. 这里我也给不出形成共价键的范围，但是，只要多测量几个晶体中的不可逆抑制剂的共价键，应该会得到一个大概的范围。
2. CYS在hinge区我所知道有 Group3F （帖子图2）：EGFR，erbB2, erbB4, Bmx, Btk, Itk, TEC, Txk, Blk, JAK3这个十个。hinge区其他位置有Cys的还有b-Raf，但是，这些Cys靠近hinge区的氢键供（受）体处，如果针对此处引入共价键作用，是不是会破坏最重要的hinge氢键，而失去活性也是需要考虑的。
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-8 09:43
中科院-石头 发表于 2012-11-7 18:27
1. 这里我也给不出形成共价键的范围，但是，只要多测量几个晶体中的不可逆抑制剂的共价键，应该会得到一个 ...
并不是所有的潜效化合物都会与HINGE区的某个或更多的AA形成氢键吧，如果是其它位置有弱作用了，在此基础上，HINGE的CYS刚好在位置或其它方面满足这种共价作用，理论上讲是可以的吧？
你觉得呢？
难道说所有的激酶抑制剂都和HINGE区有氢键作用，没统计过这个？你有关注过嘛？
另外就是，我还是不会看，怎么看CYS在什么位置然后能找出它相对应的不同激酶555。在这些激酶中，可能又由于位置等不匹配会剔除一些激酶，这样又是一个选择性的提高，对吧。
顺便说声，这个帖子太棒了，必须再赞一个哈哈！
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-8 13:55
SYPHU_me 发表于 2012-11-8 09:43
并不是所有的潜效化合物都会与HINGE区的某个或更多的AA形成氢键吧，如果是其它位置有弱作用了，在此基础 ...
1. 理论上是可以的，目前还没有见过这方面的抑制剂出现，如果能得到，至少在学术角度上是个好工作。
2. 至于hinge区氢键是否必要，我也不敢说全部都得需要，但是，至少目前上市的14个激酶抑制剂都有相应的片段与hinge区能够形成氢键。或者说，按照这种模式设计，风险会小些。
3. 虽然回复过你，但是为了其他朋友能了解，还是再说下。将蛋白序列比对一下，在hinge区相应的氨基酸序列寻找CYS就可以，而且这个工作已经有不少人做过，得出的结论是在hinge区末端有CYS的就那十种蛋白。
作者: 川大-灰太狼 时间: 2012-11-9 12:11
中科院-石头 发表于 2012-11-7 18:12
1. 根据文献的原话“To our knowledge, there are no reports to date that describe covalent kinase inh ...
石头兄，文献说的目前只有Lys和Cys那是针对激酶抑制剂来说的。小分子与蛋白形成共价键还可以有其他氨基酸残基，比如-CN（氰基）与Ser（苏氨酸残基），例子是DPP4不可逆性抑制剂。我个人认为，共价键药物针对癌症方面的治疗有其特殊的意义，但针对慢性疾病，如心血管疾病，需要长期服用的需要谨慎。另外一个列子就是利福平，它是目前为止治疗肺结核，完全清除活跃期和静止期最为有效的药物，它与细菌的RNA聚合酶形成共价键结合。但它的副作用也很明显，因此从是否设计共价键药物来看，要把握一个平衡（疗效和安全性之间的平衡）。这个就像郭宗儒老先生说的，开发环氧化酶抑制剂时采用的适当抑制而非完全抑制的思路有异曲同工之妙。
作者: 川大-灰太狼 时间: 2012-11-9 12:21
SYPHU_me 发表于 2012-11-8 09:43
并不是所有的潜效化合物都会与HINGE区的某个或更多的AA形成氢键吧，如果是其它位置有弱作用了，在此基础 ...
对于是否所有潜在有效化合物都会与铰链区（Hinge region）形成一个或者更多氢键，从我做的现有激酶抑制剂的初步统计来看，答案是：至少存在一个氢键，并且此一个氢键必须是N原子受体与Met的主链NH形成的；如果是氧原子，则必须要与Met主链形成两个氢键，一个是配体接收氢，一个是配体提供氢。除此两种模式外，活性均不好。
PS：生物体中的N原子视乎还有生物识别的作用！在某些情况下是不能用生物电子等排体O，S等替换的。这可能是一个生物的潜规则，可以解释为什么DNA，ATP等都由N而非氧来形成重要氢键，从而启动生物功能。
作者: SYPHU_me 时间: 2012-11-9 12:37
川大-灰太狼 发表于 2012-11-9 12:21
对于是否所有潜在有效化合物都会与铰链区（Hinge region）形成一个或者更多氢键，从我做的现有激酶抑制 ...
PS那个有点意思哈！
这里的Met是指什么，methionine吗？还是其它的什么？
作者: 川大-灰太狼 时间: 2012-11-9 12:52
SYPHU_me 发表于 2012-11-9 12:37
PS那个有点意思哈！
这里的Met是指什么，methionine吗？还是其它的什么？
甲硫氨酸(Met)
作者: wangqiang306 时间: 2012-11-20 19:53
非常好，围观学习了
作者: shuc.chen 时间: 2012-11-27 09:29
记得当时筛选能与keap1迈克尔加成反应的小分子配体时，先用了desmond的一个模块，具体名字记不清了，对有迈克尔受体双键特征的小分子做了下初筛，然后用autodock虚拟筛选，最后发现小分子的binding energy都是负值，我们当时的推理就是小分子与受体的特定结合口袋要通过非键相互作用结合上去，随后特定的小分子构象，在三维空间的取向上要利于发生共价反应，这个可以通过写些脚本来分析距离吧，当时都没做，体外实验也没做。
值得注意的是几个阳性参照小分子与keap1的结合能都不高，我们推断太高或是太低都不行，应该有个范围
关于非键相互作用与成键相互作用的关系值得探讨
作者: shuc.chen 时间: 2012-11-27 09:31
这个是不是可以类比酶的催化反应，这个算是研究的比较久了
作者: 中科院-石头 时间: 2012-11-27 13:48
shuc.chen 发表于 2012-11-27 09:29
记得当时筛选能与keap1迈克尔加成反应的小分子配体时，先用了desmond的一个模块，具体名字记不清了，对有迈 ...
现在还没看到比较好的方法来模拟成键作用对接。如果用schrongdinger中的Glide来对接，可以设定迈克受体在半胱氨酸附近出现，但是这个权重不好把握，也就是说，无法估计因共价键结合可能损失的最优非键作用构象。再加上部分蛋白残基的柔性，更增加了不确定性。
作者: shuc.chen 时间: 2013-7-8 13:33
今天又重温了这个话题，很有意思，我自己很久以前也困惑过这个问题，首先还是要弄明白非相互作用怎么表征？然后从酶催化的分子机理作参考，弄清楚诸如CYS与小分子配体发生化学反应时，非键作用到底是怎么发挥作用的？最后从一系列这种反应机理提取出规律或模型。。。
作者: xxffliu 时间: 2013-7-10 03:54
先筛选弱活性先导，然后在合适的位置组装迈克尔加成受体。或者直接进行骨架跃迁替换。
keap1那个Cys想得到共价小分子抑制剂有点困难，离通道中心太远了，一般小分子的空间取向很难达到要求。
作者: shuc.chen 时间: 2013-7-10 09:46
xxffliu 发表于 2013-7-10 03:54
先筛选弱活性先导，然后在合适的位置组装迈克尔加成受体。或者直接进行骨架跃迁替换。
keap1那个Cys想得到 ...
我觉得思路有点问题：如果先筛选弱活性先导，再修饰骨架，这样不管是后期组装的迈克尔加成受体还是骨架跃迁都可能极大地影响先导分子的非键作用性质，换句话说就是你修饰完骨架，对于是否有利于发生共价反应的影响是极不确定的，这样倒不如直接筛选。
弱弱地问keap1分子和通道中心有什么关系？下面摘自维基百科
Keap1 has four discrete protein domains. The N-terminal Broad complex, Tramtrack and Bric-à-Brac (BTB) domain contains the Cys151 residue, which one of the important cysteines in stress sensing. The intervening region (IVR) domain contains two critical cysteine residues, Cys273 and Cys288, which are a second group of cysteines important for stress sensing. A double glycine repeat (DGR) and C-terminal region (CTR) domains collaborate to form a β-propeller structure, which is where Keap1 interacts with Nrf2
这个设计keap1的共价小分子抑制剂可以在包含Cys273 和 Cys288的活性区域内筛选的。不知道你的设计区域在哪里？
PS：正如楼主回复的，我现在对于非键相互作用是如何影响成键作用发生的影响是也很感兴趣？我现在就想多找些这样的分子蛋白体系作为研究对象
作者: xxffliu 时间: 2013-7-11 04:40
shuc.chen 发表于 2013-7-10 09:46
我觉得思路有点问题：如果先筛选弱活性先导，再修饰骨架，这样不管是后期组装的迈克尔加成受体还是骨架跃 ...
是的，你说的有一定道理，后组装的迈克尔受体的构象和活性都可能会改变，但是并不是全部。只要骨架跃迁的构象合适，是完全可以支持迈克尔受体在与模版相同位置形成所需共价键，我们最近通过虚拟骨架跃迁找到了一个新的激酶抑制剂，根据分子对接指导迈克尔受体组装，所得结构与模版重叠很好，活性测试证明确实形成了共价键。当然也许我们运气好找到了这样一个新骨架，但是也表明这条路并不是完全走不通的。另一方面虽然大部分已知共价抑制剂都是通过筛选得到，但不是虚拟筛选，如你所述，现有对接方法不是真实模拟这个共价作用，所以我怀疑完全基于结构的虚拟筛选成功率估计不会很高。很多文章中也是把可逆抑制剂定向的改成了不可逆的，如最近合肥高场实验室报道的BMX抑制剂。
另外我所指keap1通道可能是表述不当，实际是propeller的中心，即nrf2结合位置，附近有一个cys434。我以为你指的是这个，后来发现你提到的那两个关键残基不在这个结构里。
你想要做的那个恐怕得用量化研究成键过程。
作者: chongju135 时间: 2015-12-9 15:49
共价结合的小分子还是有研究价值的，谢谢楼主分享
作者: 风姿花传 时间: 2016-10-27 10:56
學習了 謝謝
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