【PROTAC】新药开发系列（六）双功能分子的优势
1概述前面四篇文章介绍了Craig M. Crews等人在2001、2003、2004和2008年的开创性工作。接下来，研究者总结了现有双功能分子的故事。双功能分子可以特异性地将两种或多种蛋白质分子结合在一起，从而获得增强的或新的生物效应。第一类双功能分子是雷帕霉素和FK506，其可以诱导FKBP12与雷帕霉素蛋白（mTOR）或者FK1012“二聚化”。随着化学遗传学和细胞生物学的新应用，双功能分子的应用扩展到介导促旋酶B二聚化的香豆素（Coumermycin），诱导蛋白水解的靶向嵌合分子（PROTACs），药物杂合体（Drug Hybrids），以及抗体偶联分子（ADC）等方向。
https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01ubiaZ4ibgXCPXTSCEjicvVu4HNEiayqZIByMqENXK1iadaN9vic3sM3B9iaQlg/640?wx_fmt=png图1 双功能分子的作用机制双功能分子可像与两种蛋白相互作用的天然产物一样简单，如香豆素（Coumermycin）或真菌毒素（Brefeldin A）。它们通过稳定非激活的GDP-Arf和鸟嘌呤核苷酸交换因子的复合物来抑制小G蛋白Arf。但大多数双功能分子是由结合两个蛋白的分子通过中间适当长度的Linker组成。如分子与蛋白结合的接头相同，则该分子可使两个相同的蛋白单体二聚化；如接头不同，则可以将两种不同的蛋白结合在一起。这些分子的应用与设计多种多样。两种或更多蛋白的结合可以引起受体或二分转录因子的配体非依赖性激活，而双功能分子可隔离蛋白与蛋白的结合，或诱导靶向蛋白的降解，或产生其它蛋白识别的结合表面，使得信号可正负调节。双功能分子还可特异性定位毒素，如“Drug Hybrids”可以使两种蛋白不形成二聚体。更重要的是，这些效应可通过改变小分子浓度而调节，也是可逆的。
“二聚化学诱导剂”（CID）的概念是Schreiber等人提出的。他们利用天然产物FK506与FKBP12蛋白特异性结合，募集蛋白磷酸酶神经钙蛋白形成FK506-FKBP12复合物。他们还发现结合FK1012的FK506二聚体会促使FKBP12同源二聚化。类似地，天然产物雷帕霉素可促进FKBP12与mTor的FKBP-雷帕霉素（FRB）结合。故，雷帕霉素可用于异源二聚化含有FKBP和FRB结构域的蛋白质复合物，也可用于诱导FK506-环孢菌素复合物的异二聚化，其将FKBP12和亲环蛋白结合在一起。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01urnTNMoCg48OHZpHWo3732XibnuVEYK851BTXicqmIehyrHPECv2QpQFw/640?wx_fmt=png图2 酵母三杂交系统接下来，研究者对FKBP的CID应用多样性进行了全面评估。一个重要的方向是用于鉴定小分子蛋白靶标的“酵母三杂交”系统。与检测蛋白-蛋白相互作用的酵母双杂交方法类似，该方法使转录激活域与DNA结合域接触，使得报告基因转录。该方法不依赖于蛋白-蛋白相互作用来激活转录，而是使用CID，其具有与DNA结合域作用的接头，以及与激活域作用的接头。如果后者的接头是匹配未知目标蛋白的小分子，激活域-cDNA结合文库可用于鉴定可能作用的蛋白靶标。该系统的第一个实例是将FK506与地塞米松连接，其可将FKBP12和糖皮质激素受体结合在一起。
2实例接下来详细地讨论三类双功能分子：1、仅用于细胞外研究的；2、细胞中使用，但需要对蛋白进行基因操作的（本文简略）；3、靶向内源蛋白，不需要遗传操作的。
1、仅用于细胞外研究的双功能分子https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uWRo9ISZ62BYZf0Jpx7bS5cx5ZicBtiaicPmE8A9jLBFk36x0DWlmBh9icg/640?wx_fmt=png图3 DHFR双功能分子Kopytek 等人在体外研究的甲氨蝶呤（MTX）的二聚化系统是最早被淘汰的FK506/雷帕霉素的CID之一。叶酸类似物与二氢叶酸还原酶（DHFR）结合异常紧密，可抑制关键酶在核苷酸生物合成中的功能。研究者基于MTX-DHFR相互作用的结构信息，选择对结合不重要的MTX区域，并设计适当长度的Linker，将第一个接头与第二个MTX上相同位点的分子接头连接起来。遗憾的是，这几种有趣的小分子仅在体外实验有效。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01udSPib9hJ7v5gvEJib9yUOs58Okiad0h7TKichfCIWn5VAWKrsyaagFeibFA/640?wx_fmt=png图4 PLA2双功能分子接下来，又有人提出了类似的同源二聚体系统。人非胰腺磷脂酶A2（PLA2）是参与花生四烯酸和溶血磷脂代谢的酶，涉及炎症过程。酶的扁平面与磷脂双层紧密相互作用。使用已知的i-face结合吲哚抑制剂，研究者构建了具有各种接头的双吲哚配体，此双功能分子能二聚化该酶，且对PLA2活性的抑制比单体吲哚高5倍，不仅可作为PLA2过表达类风湿性关节炎的治疗剂，也是新型的CID系统。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uUAZ0scyzJUyVlpRzBl1zxdXPAER9kNicLO8wbOuGS5AfO6g8HpNtNCQ/640?wx_fmt=png图5 SAP双功能分子1另外两个例子也是建立在CID范例之上，但它是从一个小分子/两个蛋白质（三元）系统扩展到多元系统，导致更紧密的蛋白-蛋白相互作用。霍乱毒素B和人类先天免疫系统蛋白血清淀粉样蛋白P（SAP）以五聚体形式存在；霍乱毒素可能通过与SAP聚集而被解毒。研究者推断每个霍乱毒素五聚体可以结合五个双功能分子，每个分子都会与SAP结合，从而产生高亲和力相互作用。故使用基于结构的设计，利用已知的SAP配体（D-脯氨酸）和霍乱毒素配体（m-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷，MNPG），合成了一种同时结合SAP和霍乱毒素的化合物。它比单用MNPG更能有效地抑制霍乱毒素与其它受体的结合。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01u6bkq7DUicDiaoTVXKulzxtfsgDHricxK8ZgNKvzjXKjLABe01zFF3r2WA/640?wx_fmt=png图6 SAP双功能分子2同样，Solomon 等人将志贺毒素靶向SAP。然而，他们不是依赖于五个二聚体分子的结合，而是构建了一个五臂树枝状大分子，每个连接臂以异双功能“糖簇”结束。每个糖簇由志贺毒素结合三糖和SAP结合组成甘油的环状丙酮酸。在志贺毒素竞争性结合试验中，树枝状大分子比单体糖簇能更好地破坏志贺毒素-靶标结合。
2、需要遗传操作的技术在活细胞中起作用的二聚化技术与仅在体外测试的相比更接近于生物体测试或临床应用。然而，许多方法（包括原始CID）需要遗传操作来掺入二聚化物靶标和目标蛋白质的嵌合蛋白质。因此，其在临床的应用是有限的，尽管它们肯定是强大的研究工具。这里我们就简略了！https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uNHF1icicRFTDjIyzib5tWsHOjecmficPegdlt1G3tgXIHKEheczbc5fapg/640?wx_fmt=png图7 需要遗传操作的双功能分子
3、不需要遗传操作的技术临床上我们不能轻易地对患者的细胞进行遗传操作，开发双功能小分子的吸引力在于不需要对处理过的细胞进行遗传操作就能发挥作用。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uZnNFMoHHuPLGicgvynhc3JsTg8SN0rYQYlbzickQPH2OVlWEc1ibSvibOA/640?wx_fmt=png图8 DNA烷化剂类靶向乳腺癌的双功能分子最早的两个例子主要是为非选择性的化合物提供选择性，它们靶向细胞内雌激素受体（ER）。其一，Rink等人发现的一种系统，是将DNA烷化剂与识别ER的部分连接上，从而赋予其选择性。氮芥以非特异性方式烷基化DNA，对细胞具有普遍的毒性。2-苯基吲哚与其靶标ER特异性结合可让氮芥靶向肿瘤细胞。发现对ER没有亲和力的化合物对两种细胞（来自乳腺肿瘤的ER阳性MCF7细胞和ER阴性MDA-MB-231细胞）都显示出毒性，而对ER具有亲和力的双功能分子对MCF7细胞的毒性高于MDA-MB-231细胞。用药后，再使用雌二醇处理，发现其对MCF7细胞的毒性降低，这表明雌二醇与双功能分子对ER有竞争性结合。研究者提出了对选择性的各种解释，并随后优化了它们的结构，改变了接头长度并使用雌二醇作为ER配体。其中最合理的解释是结合2-苯基吲哚的ER屏蔽了受损DNA与修复酶的结合。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uqwnSx4ibdreFWBNxHpkVdvfkbPj6Vx45LVYzJVibzPqJrUXZQjw6A8QA/640?wx_fmt=png图9 降解ER的双功能分子第二个双功能分子则是改变了格尔德霉素的毒性。格尔德霉素是与分子伴侣Hsp90结合并诱导蛋白酶体依赖性降解一系列蛋白的天然产物。但这非选择性降解导致了严重的毒副作用。研究者利用这种毒性策略，将与ER结合的雌二醇与格尔德霉素衍生物连接起来。在MCF7细胞中，格尔德霉素诱导ER，HER-2，Raf-1和IGF1R的快速降解。化合物11仅诱导ER的降解，对Raf-1或IGF1R没有影响，对HER-2降解的速率也较格尔德霉素低。化合物的活性依赖于蛋白类型和Linker长度。还有一种双功能分子，将雌二醇与可光活化的卟啉连接起来，该分子可杀死暴露于红光中的细胞。这些研究表明，将有毒性化合物与靶向部分连接，可以极大地改善毒性的选择性。
类似的方法用于靶向雄激素受体（AR）的降解。雄激素受体是与前列腺癌相关的重要靶点。用AR的配体睾酮制备格尔德霉素双功能分子，研究者发现该分子对LNCaP前列腺癌细胞具有与格尔德霉素相当的细胞毒性。试验显示，在AR依赖性细胞中，其具有与格尔德霉素相当的IC50。相反，在AR非依赖性细胞中，发现双功能分子比格尔德霉素弱十倍以上，因此提供了有希望的治疗策略。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01u5tGlK1eQ1iaWT9iaoABoE3eAn2wRr9HkgN0m3NpJVhYx36hjvHSj6sbw/640?wx_fmt=png图10 PROTAC类的双功能分子作用机制异双功能分子在泛素依赖的蛋白降解领域发挥了重要作用：通过诱导目标蛋白与泛素连接酶接近，让目标蛋白被泛素化标记，标记后的蛋白将被蛋白酶体降解。PROteolysis TArgeting Chimeras（PROTACs）利用泛素化蛋白-蛋白酶体途径，清除目标蛋白质。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uX7pQq2F3s3mA8lZK4qccQZgoNIA5yFE3fe1QC5mQpMJuW6e38LCdXA/640?wx_fmt=png图11 PROTAC类的双功能分子最初的概念验证是设计了PROTACs降解甲硫氨酸氨肽酶-2（MetAP-2）。这在我们的【PROTACs】新药研发系列（二）中详述了。从这个体外试验开始，PROTAC概念已朝着作为治疗药物的潜在用途发展。随后的论文分别使用雌二醇和二羟基睾酮的PROTACs来降解雌激素和雄激素受体。与VHL结合的7肽被简化为可透膜的五肽。接下来，研究者还设计了一种针对AR的小分子（非肽）PROTAC，使用MDM2结合的nutlin衍生物作为E3连接酶结合部分。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uvNeAjyG0KdENJeeJuDEWYblj5AbJibXx3QJf0oJTdqCv245lK3LBNXw/640?wx_fmt=png图12 连接细胞表面受体与抗体的双功能分子作用机制近年来，异双功能分子在免疫系统领域也充分地展示了巨大的潜力，这是20世纪90年代早期提出的一种策略。Kiessling等人合成了一个小分子，其能够选择性地将常见的人类抗体招募到细胞表面αvβ3整合素受体上，该受体在癌细胞表面过度表达，而在正常组织细胞中大量缺失。这种策略可引导免疫系统特异性靶向杀死癌细胞。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01uHP3anLPls9oAicxORsIiaxBFLEfAVSDPTuSCYYhe0vePicBOfAazxr6Eg/640?wx_fmt=png图13 连接Anti-Gal与Integrinαvβ3的双功能分子作为初始步骤，有两个配体分子均表现出潜力（低nM浓度）和针对αvβ3良好的特异选择性，这两个分子用以构成双功能分子的一端。从αvβ3整合素受体与其中一个配体（环状RGD肽）的晶体复合物结构可知，该分子连接一个Linker不会阻碍其与受体的结合，分子的另一端则需要去识别抗体表位。碳水化合物的α-Gal对抗体表位具有免疫原性。因为于细菌的α-Gal暴露于细菌外部，抗Gal抗体在人体中高表达。因此，另一端我们可选择适当功能化的三糖部分用于抗体的招募。这两个双功能分子阻碍了αvβ3整合素受体与其天然结合底物纤维蛋白原的结合，IC50达到了纳摩尔。但它们与αvβ3整合素受体结合的IC50值仅在微摩尔，这表明所述双功能分子具有对抗体的特异选择性。化合物15还显示出同时结合αvβ3整合素受体和抗Gal的IgG特性，这证明了该策略有可能提供特异性靶向肿瘤细胞的新疗法。后续试验证实，化合物仅杀灭高水平表达αvβ3整合素受体的细胞，而低受体表达水平的细胞存活了。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01ueYvU6FcGViclyMZZnxCmbaVPTenaEkfxFSib6gYBibch8jMmU3hvZLTMg/640?wx_fmt=png图14 连接CD22与Anti-nitrophenol的双功能分子在类似的方法中，O'Reilly 等人将抗原硝基酚（人体中存在其内源性抗体）与能结合CD22的三糖配体连接。CD22是在B细胞表面表达的蛋白。这样的双功能分子能够诱导十聚体抗硝基酚IgM与B细胞的CD22分子簇形成复合物，使得这些原本低亲和力的受体能与抗体相互结合，导致B细胞被免疫系统杀死。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01u9GQHaGQGv24FsAYt1TufY867SJDpswOGd8zsicXmXpDKtZkeaqvOovg/640?wx_fmt=png图15 连接P-Selectin与Integrinβ1的双功能分子使用不同的方法，Matsuda 等人对淋巴细胞-内皮细胞相互作用进行了研究，这对于抗炎和抗转移治疗干预作用巨大。他们发现一些化合物可结合选择素和整合素蛋白，因此他们设计了一种嵌合分子，将与P-选择素蛋白结合的四糖与柔性的的KG二肽Linker和与整合素蛋白结合的四肽RGDS融合成一体。该化合物可以形成与P-选择素和整合素β1的三元复合物。在初步测试中，该异双功能分子抑制T细胞与胶原涂层板的结合，而单个四肽和四糖则不能。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01u7c0MxPT0W72sDws2P5iaxLz5icRaJsyepAkiaaScQctr7Sia4flgdVIWHw/640?wx_fmt=png图16 连接μ与δ阿片受体的双功能分子Portoghese实验室（他们长期研究阿片受体的作用），报道了一种异双功能分子，在小鼠试验中观察到：它不仅比吗啡作用强50倍，具有良好的耐受性，且无依赖性。所谓的“MDAN”配体（μ-δ激动剂-拮抗剂）包含μ阿片受体（羟吗啡酮）的激动剂和δ受体（纳曲吲哚）的拮抗剂。MDAN-21，在两个药效团之间含有21个原子的Linker，既不产生耐受性也不产生依赖性，但较短的Liner则会产生依赖性和耐受性。研究者总结，这种生物学效应可能是因为μ和δ受体之间形成异二聚体的结果。
帕金森氏症和阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病通过尚未完全了解的复杂机制起作用，这导致许多人认为药物混合物可能是实现改善治疗效果的必要条件。而双功能分子可以代替多种药物混合使用治疗疾病，因此该领域和其他领域的研究人员正在转向双功能分子的研发。与本综述中讨论的许多其它双功能分子不同，这些“药物杂合体”倾向于将两种功能元件结合到单一框架中，可得到比通过长接头连接两个不同片段更小的药物分子。虽然该策略适合于实现两种不同的生物效应，但它不可能成功诱导形成具有两种生物分子的三元复合物。https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/icwRwl0DrJQZeJ7gL7fDyw0Na1UTGv01ujdKhTibAQBs2k8YMl6Bv0HJHCLbRkYkFDBYLnuHk0qFzdwPbuLyGEkQ/640?wx_fmt=png图17 帕金森氏症和阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病的双功能分子在帕金森氏病患者的脑中，单胺氧化酶（MAO）活性和铁的水平增加。研究发现神经保护作用可能与8-羟基喹啉的铁螯合剂和MAO抑制炔丙基胺有关，故Youdim等人将这两种成分结合成一系列具有两种功能的分子。获得了化合物19的最佳结果，其在体外表现出良好的铁螯合水平，并且在P19细胞中提供针对氧化应激的神经保护作用，而抑制MAO活性的能力相对较弱。类似地，研究者在阿尔茨海默病的试验中，将模拟NO作用的硝酸酯与具有简单神经保护性的γ-氨基丁酸受体激动剂氯美噻唑中的杂环连接起来，构成一种双功能分子，其中一个分子GT1061，是一种口服有效，且能透过血脑屏障的分子，其已在大鼠中广泛研究，并已被批准用于阿尔茨海默病的I期临床试验。
有研究者在C＆ENews中发表了用于治疗疟疾的Drug Hybrids的例子。与上面讨论的神经退行性疾病的治疗一样，这些杂合体不与两个单独的生物分子形成三元复合物，而是充当结合两个不同靶标的双功能分子。尽管在给药、递送和定位方面它们可能比药物鸡尾酒更具优势，但是杂合体在体内是否保持完整尚不清楚。目前，已经有几种靶向疟疾的双功能分子。比如，利用速效青蒿素和缓慢作用奎宁之间的协同作用，设计了一种杂合体，其IC50和单独使用其中一种药物或同时使用两种药物一样。此外，Peyton实验室已将已知抗疟氯喹的喹啉部分与已知阻断从其作用位点除去氯喹的转运蛋白作用的三环“逆转剂”连接。这使得杂合体在培养物中表现出对恶性疟原虫的有效生长抑制，并且在小鼠中观察到了有希望的早期结果。
3总结在过去的十年中，异双功能小分子的使用取得了重大进展。已经成熟的FK506/雷帕霉素系统得到了最广泛的研究和验证，预示着它们有可能解决生物医学研究中的许多突出问题，并在未来转向治疗应用。
模块化合成的好处不容小觑：如果采用冗长的线性合成路线，微调异双功能分子任一端，可能需要重新设计合成路线。许多报道的双功能分子是利用已知与特定蛋白结合的小分子（抑制剂或激动剂），故很少需要从头开始合成。实际上，可从大量的药物发现文献中获得与蛋白质结合的小分子，使得这些蛋白可以在异双功能分子的未来研究中容易地被靶向。此外，值得注意的是，小分子不一定必须与蛋白的活性位点结合才有用：任何高亲和力配体都能够促进所需的相互作用。
Linker连接的位点是至关重要的：特别是要避免破坏药效团或诱导损害结合亲和力的构象变化。尽管Linker组成通常受可合成性的限制，但确定最佳Linker的长度至关重要（这通常根据经验确定，较小的长度差异能够导致显著的活性变化）。合适的Linker足够长且足够灵活，以使分子的两端能够与其结合的蛋白靶标自由相互作用。合适的Linker也足够短，以确保蛋白质足够接近所需的二聚化效应。Linker不应过度疏水（这会促进水溶液中的分子内相互作用），或过于活泼（例如，酯类可能在体内裂解）。作为潜在治疗剂的双功能分子的主要缺点之一是它们的大尺寸。庞大的分子可能不溶，故不能口服吸收，同时透膜性也差，药代动力学性质也不理想。将来，在临床应用双功能分子之前，最小化配体和接头大小，以及整体结构的优化将是克服上述问题的关键。DrugHybrids的成功表明这是可能的。
参考文献1. Corson, T. W.; Aberle, N.; Crews, C. M., Designand Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads AreBetter Than One.ACSChem Biol 2008, 3(11), 677-692. DOI:10.1021/cb8001792【分迪科技 PROTAC践行者】期待与您合作！028-85160035sales@moldesinger.comwww.moldesigner.com
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